معلومة

ما هي الأسباب المحتملة لعدم إعطاء قالب الحمض النووي التضخيم؟

ما هي الأسباب المحتملة لعدم إعطاء قالب الحمض النووي التضخيم؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أحاول تضخيم أجزاء بطول 10 كيلو بايت تقريبًا باستخدام NEB LongAmp Master Mix. كنت أستخدم قسامة معينة من الحمض النووي (كمية القالب في كل تفاعل PCR يبلغ 10ul حوالي 60 نانوغرام) وأحصل على نتائج التضخيم حسب الرغبة. ومع ذلك ، عندما تحولت إلى قسامة مختلفة بتركيز مماثل ، لم أحصل على تضخيم مفاجئ. لقد جربت عينة مختلفة من الحمض النووي وأشعال مختلفة وحصلت على نتائج. لذا فإن المشكلة تكمن في القالب أو الاشعال. لقد حاولت زيادة كمية القالب ، وزيادة Mg2+ بمقدار 1 مليون في رد الفعل النهائي وما إلى ذلك ولكن دون جدوى. يتم تخزين قوالب الحمض النووي / 100 مرة من مخزون التمهيدي في درجة حرارة -20 درجة مئوية وتم استخراج الحمض النووي من الفينول كلوروفورم. ما الذي يمكن أن يكون خطأ هنا؟


دعنا نلخص التعليقات في إجابة حقيقية: عندما تغيرت المادة الكيميائية الوحيدة في تفاعلك هي الحمض النووي ، الذي جاء من تحضير الفينول / الكلوروفورم الطازج ، سأشك في ذلك. من هناك ، لدينا بعض الاحتمالات ، ما كان يمكن أن يحدث بشكل خاطئ.

  1. السبب الأكثر ترجيحًا للتفاعل الأنزيمي الذي لا يعمل مع الحمض النووي المحضر للفينول / الكلوروفورم هو بقايا (أو ترحيل) المذيبات العضوية من التفاعل. تمنع التفاعلات الأنزيمية (خاصة الفينول) بكفاءة عالية. سيساعد القيام بجولة أخرى من ترسيب الحمض النووي.
  2. من المحتمل أن الحمض النووي الخاص بك لم يتحلل بعد خطوة التجفيف في الترسيب. اعتمادًا على الظروف ، يمكن للحمض النووي أن يشكل حبيبة يصعب رؤيتها ويصعب حلها. لذلك سيكون تركيز الحمض النووي الخاص بك منخفضًا جدًا للحصول على التضخيم. لمنع هذا قياس تركيز الحمض النووي الخاص بك.
  3. من المحتمل أن المياه التي استخدمتها كانت ملوثة بالحمض النووي (على الرغم من أنه لا ينبغي ذلك) وأن حمضك النووي قد تدهور بسببها. هنا فقط قسامات جديدة ستساعد.
  4. اعتمادًا على حجم amplicon الخاص بك ، من الممكن أن تؤدي الظروف القاسية جدًا أثناء التحضير إلى قص الحمض النووي ، مما لا يترك ما يكفي من الحمض النووي السليم للحصول على التضخيم المناسب. إذا كانت هذه هي الحالة ، فكن أكثر لطفًا مع الاستخراج.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون البرايمر مشكلة. سيكون من الجيد الحفاظ على حلول المخزون 100x بشكل دائم عند -20 درجة مئوية وإعداد حلول عمل 10x. يمكن أن تخضع هذه المواد للتجميد والذوبان (مما يؤدي إلى تدهور حالتها بمرور الوقت) ولكن يمكن استبدالها بسهولة. سأجرب أيضًا الإعداد الجديد للحمض النووي (إن أمكن جنبًا إلى جنب مع واحد يعمل) باستخدام مواد أولية جديدة لاختبار ما إذا كانت هي المشكلة.


عند الانتهاء من موضوع هذه الوحدة ، سوف:

  • كن قادرًا على إعداد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام عينات الحمض النووي ، والبادئات ، والمخزن ، و dNTPs ، وإنزيم البوليميراز. يجب أن تكون قادرًا على شرح أهمية ودور كل مكون في التفاعل.
  • كن قادرًا على تحميل عينات PCR في آلة التدوير الحراري ووصف الآليات الكامنة وراء الخطوات المختلفة التي تحدث داخل جهاز التدوير الحراري خلال تفاعل PCR.
  • كن قادرًا على شرح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي والطريقتين الشائعتين للكشف.
  • أن تكون قادرًا على شرح آلية تسلسل الحمض النووي وتحديد مزايا استخدام طريقة إنهاء الصبغة.

تاريخ

تم وصف محول الوصلة PCR لأول مرة في عام 1989. 9 في هذه الطريقة ، يتم هضم الحمض النووي المستهدف باستخدام إنزيم تقييد مناسب ثم يتم ربط كل طرف بمحول. تُستخدم تسلسلات المحولات المعروفة هذه لتضخيم كل جزء من أجزاء الحمض النووي العديدة التي تمثل العينة الأصلية بشكل موحد. تعتمد الطريقة على ربط فعال للغاية وتضخيم غير متحيز بين المناطق الأولية المتطابقة (انظر شكل 1).

شكل 1. آلية PCR محول الرابط

في المقابل ، يستخدم التضخيم المسبق لتمديد التمهيدي (PEP) PCR مجموعة من السداسيات العشوائية لتجهيز الحمض النووي للقالب. 10 تستخدم ظروف التدوير الحراري اللاحقة درجات حرارة تلدين منخفضة جدًا (متساهلة) وخمسين دورة أو أكثر لإنشاء سلسلة من الشظايا التي تمثل مدخلات DNA الأصلية. يرجع التحيز في منتج PEP PCR الناتج إلى عدم انتظام التلدين والتمديد السداسي العشوائي - تميل أقسام الحمض النووي ذات الأحداث التمهيدية النادرة أو البعيدة إلى التمييز ضدها في هذه الطريقة. تم التغلب على أوجه القصور هذه إلى حد كبير من خلال تضخيم إزاحة الخيوط المتعددة (MSD). 11 تستخدم تقنية MSD بوليميريز DNA ميسوفيليك فريد من نوعه ومعالج للغاية ، phi29. المنتج الناتج يتكون من شظايا طويلة ، 10-50 كيلو بايت ، ولكن تضخيم وتمثيل جيد (انظر الشكل 2).

الشكل 2. إزاحة حبلا متعددة (MSD)

أخيرًا ، يعتمد PCR التمهيدي قليل النوكليوتيد (DOP) PCR ، الموصوف أيضًا على أنه PCR التعسفي ، على مجموعة من oligos بنهاية 3'- نهاية عشوائية وتسلسل 5 ثابت جزئيًا. تم تصميم هذه البادئات لتصلب بشكل متساوٍ نسبيًا في جميع أنحاء عينة الحمض النووي. بمجرد أن يتم تمديدها بواسطة البوليميراز ، يتم تضخيم هذه المنتجات باستخدام oligos التي تستهدف تسلسلها الثابت. يعتبر التصميم التمهيدي أمرًا بالغ الأهمية لهذه التقنية - يجب أن يرتبط القلة بالتساوي نسبيًا في جميع أنحاء تسلسل الحمض النووي ولكن لا يرتبط بأوليغنوكليوتيدات أخرى. تم تطبيق هذه الطريقة أيضًا بنجاح لإعطاء عينات تمثيلية (انظر الشكل 3).

الشكل 3. آلية تفاعل البوليميراز المتسلسل الأوليغنوكليوتيد التنكسية


المواد والأساليب

تصميم الدراسة

كان الهدف من هذه الدراسة هو تحديد طريقة (طرق) التضخيم المناسبة لتشخيص PON. بعد التقييم الأولي بناءً على المعلومات المتاحة من الأدبيات ، تم اختيار العديد من الطرق نظرًا لبساطتها الفنية والتكلفة والسرعة المنخفضة نسبيًا. ثم تم تحليل هذه الطرق بمزيد من التفصيل ، بما في ذلك حد الكشف ، والتكاثر ، وسرعة التضخيم والمتانة ، لتحديد الطريقة (الطرق) المناسبة لأغراض PON. في المرحلة الأخيرة من هذه الدراسة ، تم إجراء العديد من التعديلات على اثنتين من هذه الطرق بهدف تحسين سرعة التضخيم أو المتانة.

إعداد قالب الحمض النووي

تنقية الحمض النووي من أوكسيسبوروم الفيوزاريوم f.sp. كونجلوتينان و نبات الأرابيدوبسيس thaliana تم استخدام النمط البيئي كولومبيا باعتباره الحمض النووي المستهدف والحمض النووي غير المستهدف ، على التوالي ، طوال هذه الدراسة.

الحمض النووي الجينومي من أ. ثاليانا تم تنقيته باستخدام طريقة استخلاص DNA معدلة CTAB [33]. أ. ثاليانا تم طحن الأوراق إلى قوة دقيقة باستخدام النيتروجين السائل. تمت إضافة ما يقرب من 100 ملغ من طاقة الأوراق إلى 500 ميكرولتر من محلول استخلاص 60 درجة مئوية (2٪ (وزن / حجم) CTAB ، 1.42M كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار EDTA ، 100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك [pH8.0] ، 1٪ w / v polyvinylyrilodone [PVP40 ]). تم تحضين المستخلص عند 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ثم خلطه مع 500 ميكرولتر من الكلوروفورم المبرد: isoamyl alchohol (24: 1 ، حجم / حجم). تم هز الخليط برفق عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ثم طرده عند 15000 ميكروجرام لمدة 10 دقائق. تم نقل 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد وخلطها مع 400 ميكرولتر من الإيثانول المبرد قبل أن يطرد الخليط عند 15000 ميكروغرام لمدة 10 دقائق إلى حبيبات DNA. تم غسل حبيبات الحمض النووي بـ 80٪ إيثانول و 100٪ إيثانول على التوالي. لإفساد الحمض النووي الريبي في العينة ، تم تعليق الحبيبات باستخدام 100 ميكرولتر من الماء و 50 ميكروغرام من RNase A ، ثم تم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. تم خلط العينة مع 10 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول ، تليها الحضانة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي عند 15000 جم لمدة دقيقتين ، تم الحصول على حبيبات DNA ثم غسلها بنسبة 80 ٪ من الإيثانول. بعد الجفاف ، تم تعليق الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من الماء وقياسه بواسطة مقياس الطيف الضوئي NanoDrop ND-1000.

DNA من F. كونجلوتينان تم تنقيته من الثقافات السائلة النقية. باختصار ، تم استئصال ثلاث كتل أجار بحجم 5 مم × 5 مم من لوحة الاستزراع الطازج ونقلها إلى مرق سكر العنب 200 مل ، ثم تم تحضينها في شاكر عند 28 درجة مئوية بسرعة 110 دورة في الدقيقة. بعد حوالي 4 أيام ، تم ترشيح المزرعة السائلة من خلال 4 طبقات من Miracloth للحصول على F. كونجلوتينان فطيرة. ثم تم طحن الميسليوم جيدًا باستخدام النيتروجين السائل. تمت إضافة ما يقرب من 100 مجم من طاقة الميسيليوم الدقيقة إلى 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج (150 م م تريس قاعدة ، 2٪ وزن / حجم SDS ، 50 م م إيدتا ، 1٪ حجم / حجم ب- مركابتوإيثانول ، pH 7.5) ودوامة لمدة 5 دقائق. تمت إضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول ، 44 مايكرولتر من أسيتات البوتاسيوم 5 مولار إلى المستخلص على التوالي قبل دوامة مدتها دقيقة واحدة عند إضافة كل كاشف. 500 ميكرولتر من الكلوروفورم: تمت إضافة isoamyl alchohol (24: 1، v / v) إلى الخليط وتدويره لمدة دقيقة واحدة ، متبوعًا بالطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 3 دقائق. تم نقل ما يقرب من 500 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب جديد وخلطها مع 500 ميكرولتر من الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميل (25: 24: 1 ، حجم / حجم). بعد الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 3 دقائق ، تم خلط 400 ميكرولتر من المادة الطافية مع 800 ميكرولتر من الإيثانول المبرد ثم تم تحضينها عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي عند 15000 ميكروغرام لمدة 10 دقائق ، تم تكوير الحمض النووي ثم غسله بنسبة 80 ٪ من الإيثانول ، تليها معالجة RNase ، وغسل الإيثانول ، وتقدير الحمض النووي كما هو موضح أعلاه في استخراج الحمض النووي من أ. ثاليانا.

تصميم التمهيدي

تم تصميم ستة مجموعات من بادئات LAMP (S1 Excel) مقابل إندوبوليجالكتوروناز جين F. أوكسيسبوروم (GeneBank: AB256753.1) وفقًا للوصف المفصل في منشور LAMP الأصلي [14] بمساعدة برنامج PrimerExplorer v5 (https://primerexplorer.jp/e/).

تم تصميم ثلاث مجموعات من البادئات RPA ، وثلاث مجموعات من بادئات CPA ، وثماني مجموعات من بادئات PSR وثلاث مجموعات من بادئات SEA (S1 Excel) ضد F. oxysporum endopolygalcturonase أقرب ما يكون إلى موضع التمهيدي LAMP وفقًا للوصف المفصل في المنشور الأصلي الخاص به [16–18 ، 34]. تم إجراء تعديل على تصميم التمهيدي CPA عن طريق استبدال التمهيدي 2 أ بالطريقة الأصلية باستخدام مادة أولية أخرى تسمى 6 أ والتي استهدفت تسلسلًا في اتجاه مجرى التمهيدي 5 أ (S3B الشكل).

التضخيم

ما لم يذكر خلاف ذلك ، احتوت تضخمات LAMP على 0.8 م بيتين ، 8 ملي مولار MgSO4، 1.2 ملم dNTP (لكل منهما) ، 20 ملم تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8) ، 10 ملم (NH4)2وبالتالي4، 10 ملي بوكل ، 0.1٪ (حجم / حجم) Triton® X-100 ، 1.6 ميكرومتر FIP التمهيدي ، 1.6 ميكرومتر BIP التمهيدي ، 0.2 ميكرومتر F3 التمهيدي ، 0.2 ميكرومتر B3 التمهيدي و 0.32 U / ميكرولتر Bst 2.0 بداية دافئة بوليميريز (نيو إنجلاند بيولاب). تم تحضين 10 ميكرولتر من التفاعلات عند 63 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ثم عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتمسخ الإنزيمات.

كانت مكونات تفاعلات CPA و PSR متطابقة مع تفاعلات LAMP باستثناء البادئات. تم استخدام 0.5 ميكرومتر من 1s التمهيدي ، 0.3 ميكرومتر من 2a ، 3a ، 4s و 5a الاشعال في تفاعلات CPA ، و 0.5 ميكرومتر من 1s التمهيدي ، 0.3 ميكرومتر من 3a و 5a الاشعال ، و 0.05 ميكرومتر من 4s و 6a تم استخدام الاشعال في تعديل تفاعلات CPA (mCPA). احتوت تفاعلات PSR على 1.6 ميكرومتر من Ft و Bt و 0.8 ميكرومتر من IF و IB. تم تحضين 10 ميكرولتر من التفاعلات عند 63 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في CPA أو 75 دقيقة في PSR متبوعة بـ 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

احتوت تفاعلات SEA على 2 ملي MgSO40.5 ملي dNTP (لكل منهما) ، 20 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.8) ، 10 ملي مولار (NH4)2وبالتالي4، 10 ملي كلوريد البوتاسيوم ، 0.1٪ Triton®-X-100 ، 10٪ (وزن / حجم) PEG-300 ، 1 ميكرومتر من البادئات الأمامية والخلفية و 0.8 U / ميكرولتر Bst 2.0 بوليميراز البدء الدافئ. تم تحضين 10 ميكرولتر من التفاعلات عند 63 درجة مئوية لمدة تصل إلى 180 دقيقة.

تم استخدام TwistAmp Basic RPA (Twist DX) كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، تمت إعادة ترطيب حبة RPA واحدة بـ 29.5 ميكرولتر من محلول إعادة التميؤ ، وأضيف 0.48 ميكرومتر من البادئات الأمامية والمكافأة والماء لتشكيل 42.5 ميكرولتر من المحلول. تم تقطيع الخليط بالتساوي في خمسة أنابيب 0.2 مل ، وأضيف 1 ميكرولتر قالب DNA. ما لم يذكر خلاف ذلك ، قبل الحضانة تمت إضافة 0.5 ميكرولتر من 280 ملي أسيتات المغنيسيوم إلى التفاعلات. تم تحضين تفاعلات 10 ميكرولتر من RPA عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإفساد البروتينات وإطلاق الأمبليكون. بعد الحضانة ، تم خلط 2 ميكرولتر من منتجات RPA مع 1 ميكرولتر من الصبغة التي تحتوي على 2 ٪ SDS وفحصها باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام.

اختيار التمهيدي

تم تصميم مجموعات متعددة من البادئات لكل طريقة متساوية الحرارة (S1 Excel) واختبارها باستخدام منقى F. كونجلوتينان تم استخدام الحمض النووي باعتباره الحمض النووي المستهدف. تم استبعاد مجموعات التمهيدي إذا كانت تنتج تضخيمًا غير محدد في التحكم في المياه أو لم تنتج أي تضخيم منها F. كونجلوتينان الحمض النووي. تم اختيار مجموعة تمهيدي وظيفية واحدة (جدول S1) لكل طريقة واستخدامها خلال الاختبارات المتبقية.

حد الكشف

0 ، 0.01 ، 0.1 ، 1 ، 5 ، 25 أو 50 نانوغرام من المنقى F. أوكسيسبوروم تمت إضافة الحمض النووي إلى كل نوع من التفاعل متساوي الحرارة بحجم نهائي قدره 10 ميكرولتر. تم وصف المكونات في التفاعلات وظروف التضخيم لكل طريقة في قسم "التضخيم" أعلاه.

فحوصات الفلورة في الوقت الحقيقي

لمراقبة التفاعل في الوقت الفعلي ، تمت إضافة 1.25 ميكرومتر من SYTO9 (Invitrogen) إلى تفاعلات LAMP أو RPA. 1 نانوغرام تمت تنقيته F. أوكسيسبوروم DNA و 1 نانوغرام أ.ثاليانا تمت إضافة تفاعلات الحمض النووي مثل الحمض النووي المستهدف والحمض النووي غير المستهدف على التوالي. تمت مراقبة 10 تفاعلات ميكرولتر باستخدام جهاز Lightcycler 96 في الوقت الحقيقي (Roche) عند درجة حرارة التفاعل ذات الصلة مع قياسات الفلورسنت المأخوذة كل 20 ثانية.

من البيانات الخام في الوقت الحقيقي ، تم حساب قيم دلتا (Δ) عن طريق طرح قيمة مضان البداية لكل عينة من كل قيمة. لحساب الوقت لكل عينة للوصول إلى قيمة عتبة مضان محددة (0.5 في LAMP و 0.05 في RPA) ، تم جمع ما لا يقل عن 21 نقطة بيانات تغطي مرحلة النمو اللوغاريتمي وتثبيتها على خط الانحدار بقيمة r 2 عند 0.95 على الأقل في Microsoft Excel. ثم تم استخدام دالة TREND لحساب الوقت لكل عينة للوصول إلى قيمة العتبة (Tعتبة).

تضخيم PCR

تحتوي تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل 10 ميكرولتر على 1 × مزيج رئيسي أخضر أساسي من الحمض النووي FastStart (Roche) ، و 0.2 ميكرومتر من كل تمهيدي ، وإما 10 نانوغرام من الحمض النووي المستهدف ، و 10 نانوغرام من الحمض النووي غير المستهدف أو الماء. تم إجراء التفاعلات على جهاز التدوير الحراري في الوقت الحقيقي Lightcycler 96 باستخدام المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 45 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 65 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.

تعزيز تضخيم المصباح

لاختبار ما إذا كان بإمكان RecA تسريع LAMP ، تمت إضافة 0.75 ميكروغرام من RecA (New England Biolabs) و 1 mM ATP إلى تفاعلات 10 ميكرولتر (n = 10) تحتوي إما على 0 M أو 0.4 M أو 0.8 M betaine. للتحقيق في تأثير النيوكليوتيدات في غياب RecA ، تمت إضافة 0 أو 1 أو 2 أو 3 أو 4 أو 5 أو 6 أو 7 ملي ATP أو 1 ملي dATP أو dTTP أو dGTP أو dCTP إلى تفاعلات 10 ميكرولتر تحتوي على 0.4 م بيتين ( ن = 3) على التوالي. في تجارب أخرى ، تمت إضافة 4.8 أو 8.8 أو 12.8 ملي مولار من dNTPs (الإجمالي) إلى 10 ميكرولتر من تفاعلات تحتوي على 0.4 ميكرولتر بيتين (ن = 3) وإما 8 ملي مولار أو 10 ملي مولار مغ 2+. للتحقيق في تأثيرات بادئات السرب والحلقة لتضخيم LAMP ، تم تصميم الاشعال (جدول S1) كما هو موصوف في منشوراتهم الخاصة [35 ، 36]. تمت إضافة 0.8 ميكرومتر من بادئات الحلقة الأمامية والخلفية و / أو 1.6 ميكرومتر من بادئات السرب الأمامية والخلفية إلى تفاعلات 10 ميكرولتر تحتوي على 0.4 ميكرولتر من البيتين (ن = 4).

1 نانوغرام F. أوكسيسبوروم تم استخدام الحمض النووي كقالب الحمض النووي المستهدف. تم إجراء جميع التفاعلات على Lightcycler 96 عند 63 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة متبوعة بـ 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

آثار البيتين على وظيفة RPA

تمت إضافة البيتين إلى 10 ميكرولتر من تفاعلات RPA القياسية (الموصوفة أعلاه ، ن = 4) تحتوي على 1 نانوغرام F. أوكسيسبوروم تم إجراء جميع التفاعلات على Lightcyler 96 عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة قبل تغيير خصائصها عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.

إحصائيات

للمقارنة بين مجموعتين من البيانات ، تم تحليل البيانات باستخدام اختبار t غير المقيد (غير معلمي) في GraphPad Prism (الإصدار 7.0b) (p 0.05). تم تحليل جميع مجموعات البيانات الأخرى عن طريق إجراء ANOVA أحادي الاتجاه متبوعًا بمقارنة Tukey اللاحقة لاختبار الوسائل (p 0.05) في GraphPad Prism.


RT-PCR وتصميم الفحص qPCR

تم وصف تصميم الفحص في تصميم فحص PCR / qPCR / dPCR. عند استكشاف أخطاء أحد الاختبارات وإصلاحها ، تأكد من التحقق من التصميم. تأكد من أن موضع PCR / qPCR التمهيدي وموضع amplicon متوافق مع بروتوكول فتيلة RT. على سبيل المثال ، تأكد من أن المقايسات المطبقة على (كدنا) التي تم تحضيرها بعد فتيلة oligo-dT تقع في اتجاه 3 'من النص. تأكد من أن معلومات التسلسل موثوقة وأنه قد تم النظر في متغيرات لصق مناسبة و SNPs.

الشكل 11.1 أ. يحتوي الاختبار على ملف تعريف مؤامرة تضخيم غير عادي مع انجراف واضح لخط الأساس.

الشكل 11.1 ب. تم إدخال تسلسل المسبار الذي تم تضمينه في الاختبار في برنامج التنبؤ القابل للطي mfold. من الواضح أن المسبار يمكن أن يتبنى هيكلًا مطويًا مستقرًا في المحلول ومن المحتمل أن يؤدي ذلك إلى المشكلة المرصودة.


التقنيات الفيزيائية الحيوية للتوصيف الهيكلي للجزيئات الكبيرة

JD Cossar، C.H. اروسميث ، في الفيزياء الحيوية الشاملة ، 2012

1.3.3.2 قالب استنساخ DNA و PCR

يمكن الحصول على قالب DNA لهدف بروتين محدد من المجموعات التجارية أو مجموعات أخرى من نسخ cDNA الفردية أو مكتبات cDNA أو DNA المركب كيميائيًا أو الحمض النووي الجيني (للكائنات التي تحتوي على عدد قليل من إنترونات أو مجالات مشفرة بواسطة exon واحد). تعد مستنسخات (كدنا) مصدر الاختيار الأول ويتم إنتاجها عن طريق النسخ العكسي من مجموعات الرنا المرسال لخلايا المصدر الأولية (الأنسجة الأصلية). قد تحمل cDNAs متغيرات تسلسلية (إلى حد كونها معيبة) أو تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية ، اعتمادًا على نسيج المصدر. قد تؤدي عملية توليد الحمض النووي من الرنا المرسال أيضًا إلى حدوث طفرات غير مبررة. لذلك ، يجب التحقق من تسلسل قوالب (كدنا) قبل الاستخدام.

إن القدرة على إنتاج الجينات صناعياً موجودة الآن بسهولة في القطاع التجاري والتكنولوجيا قوية نسبيًا. نظرًا لقيود التكلفة والوقت ، فإننا نحتفظ بهذه الإستراتيجية للتسلسلات غير المتوفرة مثل cDNA. يمكن أيضًا تعديل جزيء اصطناعي لاستيعاب تردد استخدام الكودون المفضل للمضيف (الشكل 2). ضمن الكودونات الـ 64 القياسية (تسلسل الحمض النووي الثلاثي المتوافق مع الأحماض الأمينية الفردية في عديد الببتيد) ، من المعروف أن الكائنات الحية المختلفة تظهر استخدامًا متنوعًا حيث يوجد أكثر من كودون واحد لحمض أميني معين (على سبيل المثال ، يحتوي الأرجينين على 6 أكواد مماثلة ، البرولين يحتوي على 4 وسيستين 2 وميثيونين 1). لذلك ، إذا كان سيتم التعبير عن البروتين في مضيف غير أصلي ، فمن الممكن مطابقة استخدام الكودون لتسلسل الحمض النووي مع ذلك الخاص بالكائن الحي المضيف. تعتمد الفائدة المحتملة على افتراض أن تقديم كودون نادر (قليل الاستخدام) في مكان غير طبيعي على الرنا المرسال يمكن أن يؤدي إلى توقف الريبوسوم والإنهاء المبكر لاستطالة سلسلة البولي ببتيد. للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة في العوائل البكتيرية ، يمكن التغلب على هذه العوامل غالبًا عن طريق التعبير المشترك مع الحمض الريبي النووي النقال التكميلي للكودونات النادرة. 14 يعتبر وجود الكودونات النادرة أيضًا بمثابة توقف مؤقت في استطالة سلسلة البولي ببتيد الوليدة ، والتي قد تسمح للطي المستقل للمجالات الهيكلية. نظرًا للفائدة غير المؤكدة إلى حد ما لتحسين الكودون ، لا نوصي بهذا النهج في التمريرة الأولى ، ويتم تحضير DNA للقالب الاصطناعي عادةً لتوفير تسلسل الترميز الأصلي.

الشكل 2 . تفضيل استخدام Codon (التحيز) في جينوم H. العاقل, بكتريا قولونية، و S. frugiperda.

غالبًا ما يكون الحمض النووي الجينومي هو الملاذ الأخير في الحالات التي يكون فيها التسلسل كبيرًا بشكل غير مقبول للتوليف ولا يتوفر كـ cDNA. يصعب استخدام الحمض النووي الجيني نسبيًا بسبب التردد المنخفض للتسلسل المستهدف في الجينوم الكلي وما يترتب على ذلك من صعوبة في الحصول على منتج PCR نظيف. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي الحمض النووي الجيني في كثير من الأحيان على إنترونات (DNA غير مشفر داخل الجين المعني) ، والتي يجب إزالتها أثناء عملية بناء الاستنساخ. إن ضرورة التلاعب المتعدد للحصول على الحمض النووي من مادة المصدر الجينومي تزيد حتمًا من خطر إدخال طفرات ضارة (الحذف أو الاستبدالات). لذلك يجب التحقق من تسلسل هذه القوالب قبل استخدامها. بسبب التردد العالي للإنترون ، لا يُعتبر الحمض النووي الجيني للثدييات نموذجًا للاستنساخ. ومع ذلك ، يتم استخدام الحمض النووي المصدر الجيني بشكل روتيني وناجح في مختبرنا كقالب للبروتينات من المتصورة المنجلية 15 والكائنات المماثلة.

بمجرد الحصول على قالب الحمض النووي المطلوب ، يكون من الملائم وضعه في ناقل استنساخ (بلازميد) لغرض التخزين والتلاعب (بما في ذلك الطفرات الموجهة للموقع) والتسلسل واستخدامه كقالب لاستنساخ مناطق معينة من أجل مزيد من المعالجة. عادة ما يتم إجراء مرحلة الحجز هذه في بكتريا قولونية نظرًا لسهولة استخدامها والإخلاص العام في استنساخ إدراج الحمض النووي. تتوفر العديد من الأنظمة ، بما في ذلك سلالة DH5α و pBluescript أو بلازميدات سلسلة Top10. لتجنب المخاوف من سمية المنتج أو التحيز القوي لمعدل النمو للمتغيرات غير المنتجة ، يكون التعبير عن منتج البروتين في حده الأدنى أو غير موجود في مثل هذه الأنظمة.


الأرقام

تم استخدام ما مجموعه خمسة عشر تسلسلًا مستهدفًا غنيًا بالـ GC وستة وعشرين تسلسلًا مستهدفًا من الحمض النووي غير الغني بالـ GC في هذه الدراسة. تسلسل الحمض النووي الغني بالـ GC الخمسة عشر من ثمانية جينات: HBA2 (NC_000016.9) ، FMR1 (NC_000023.10) ، APOE (NC_000019.9) ، HRES1 (NC_000001.9) ، CSTB (NC_000021.8) ، INSR (NC_000019) .9) ، AR (NC_000023.10) ، و GATA4 (NC_000008.10) ، مع محتوى GC لهذه البادئات التي تتراوح من 66.0٪ إلى 84.0٪ ، فإن تسلسلات الهدف الستة والعشرين غير الغنية بالـ GC هي من ستة وعشرين إكسونات الجين F8 الموجود في Xq28 ،


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو طريقة لتضخيم تسلسل الحمض النووي بسرعة. خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل النموذجي ، يتم خلط قالب الحمض النووي (الذي يحتوي على منطقة الاهتمام) مع ديوكسينوكليوتيدات (dNTPs) وبوليميراز الحمض النووي والبادئات. الاشعال عبارة عن شرائح قصيرة من الحمض النووي تتكامل مع قالب الحمض النووي المنبع للمنطقة محل الاهتمام وتعمل كمواقع توظيف للبوليميراز. يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل سلسلة من دورات درجة الحرارة التي ، على الرغم من إجرائها مرة واحدة عن طريق تحريك الأنابيب من خلال حمامات مائية مختلفة ، إلا أنه يتم التحكم فيها تلقائيًا عن طريق استخدام الدوارات الحرارية أو المعالجات الحرارية. توفر أجهزة التدوير الحراري تحكمًا صارمًا في درجة حرارة التفاعل ومدة كل خطوة من درجات الحرارة ، مما يضمن تضخيمًا فعالًا. خلال PCR نموذجي ، تتكرر دورات التمسخ والصلب والتمديد لتحقيق التضخيم الأسي للتسلسل المستهدف. يتكون التمسخ من تسخين العينات بشكل نموذجي بين 94-98 درجة مئوية لإحداث تمسخ لقالب الحمض النووي ، وتعطيل روابط الهيدروجين وتفاعلات التراص الأساسية التي تربط خيوط الحمض النووي معًا. بمجرد فصل الخيوط ، تنخفض درجة الحرارة إلى درجة حرارة التلدين للسماح للبادئات بتكوين زوج أساسي (أو صلب) إلى مناطق تكميلية للقالب. ترتبط درجة حرارة التلدين (عادةً ما بين 48-72 درجة مئوية) بدرجة حرارة الانصهار (Tm) للبادئات ويجب تحديدها لكل زوج تمهيدي مستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل. أثناء خطوة التمديد (عادةً 68-72 درجة مئوية) ، يقوم البوليميراز بتمديد التمهيدي لتشكيل حبلا DNA ناشئ. تتكرر هذه العملية عدة مرات (عادةً 25-35 دورة) ، ولأن كل خيط جديد يمكن أن يعمل أيضًا كقالب للبادئات ، يتم تضخيم منطقة الاهتمام بشكل كبير. عادةً ما تكون الخطوة الأخيرة من PCR هي خطوة واحدة أطول في درجة الحرارة (غالبًا 5-10 دقائق عند 68-72 درجة مئوية) والتي تسمح بإكمال أي نسخ جزئية وإزالة جميع آلات النسخ من الحمض النووي الناشئ. بمجرد اكتمال PCR ، يتم ضبط جهاز التدوير الحراري على 4 & deg-10 & degC للحفاظ على سلامة المنتج حتى يحين الوقت الذي يمكن فيه إزالة الأنابيب من الجهاز.


شكر وتقدير

تم تمويل هذا المشروع من قبل حكومة كندا من خلال Genome Canada ومعهد أونتاريو للجينوم من خلال مشروع Biomonitoring 2.0 (OGI-050) إلى M.H. ، وهي منحة NSF DEB 0515699 إلى D.H.J. ومؤسسة JRS للتنوع البيولوجي ومؤسسة Wege في Grand Rapids ، ميشيغان ، إلى صندوق Guanacaste Dry Forest Conservation Fund. ج. يتم تمويله أيضًا من خلال NSERC PDF. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها أو اتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو إعدادها. نحن ممتنون لـ Area de Conservación Guanacaste لحماية موطن الغابات الذي أخذنا عينات منه.

الجدول S1 بيانات Sanger و 454 التسلسل الحراري للعينات المدرجة في المسار 1.

الجدول S2 بيانات Sanger و 454 التسلسل الحراري للعينات المدرجة في المسار 2.

الجدول S3 96 تسلسل علامات MID 10-Mer مصممة حديثًا تستخدم في 454 تسلسل حراري.

يرجى ملاحظة ما يلي: الناشر غير مسؤول عن محتوى أو وظيفة أي معلومات داعمة مقدمة من المؤلفين. يجب توجيه أي استفسارات (بخلاف المحتوى المفقود) إلى المؤلف المقابل للمقالة.



تعليقات:

  1. Burl

    لا مانع من طباعة مثل هذا المنشور ، فنادراً ما تجد هذا على الإنترنت ، شكرًا!

  2. Isma'il

    هل هذه مزحة؟

  3. Fearnhealh

    إنها تتفق ، هذه الفكرة الممتازة ضرورية فقط بالمناسبة

  4. Loritz

    في رأيي ، هم مخطئون. أقترح مناقشته.

  5. Manville

    ليس الأمر كذلك.



اكتب رسالة