معلومة

ما هو بوليميريز الحمض النووي الذي يمكن أن يستخدم النك كموقع فتيلة؟

ما هو بوليميريز الحمض النووي الذي يمكن أن يستخدم النك كموقع فتيلة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ما هو بوليميريز الحمض النووي (المتوفر تجارياً) الذي يمكن أن يبدأ البلمرة عند النكات ، بدون مادة أولية قياسية؟

هدفي هو إجراء تضخيم الدائرة المتدحرجة بدءًا من النك.


يبدو أنك تبحث عن بوليميراز DNA يمكنه إجراء ترجمة للنيك. يحتفظ NEB بمخطط يسرد خصائص البوليمرات الخاصة بهم ، بما في ذلك ترجمة نيك و تمديد من نيك. بدون تفاصيل إضافية ، يبدو طق سيعمل لغرضك.


الحمض النووي التكميلي

في علم الوراثة ، الحمض النووي التكميلي (كدنا) عبارة عن DNA مُصنَّع من الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة (على سبيل المثال ، قالب RNA الرسول (mRNA) أو microRNA (miRNA)) في تفاعل يحفزه إنزيم النسخ العكسي للإنزيم. غالبًا ما يستخدم (كدنا) لاستنساخ الجينات حقيقية النواة في بدائيات النوى. عندما يريد العلماء التعبير عن بروتين معين في خلية لا تعبر عادةً عن هذا البروتين (أي التعبير غير المتجانسة) ، فإنهم سينقلون cDNA الذي يرمز للبروتين إلى الخلية المتلقية. في البيولوجيا الجزيئية ، يتم أيضًا إنشاء (كدنا) لتحليل ملامح النسخ في الأنسجة الضخمة أو الخلايا المفردة أو النوى المفردة في المقايسات مثل المصفوفات الدقيقة و RNA-seq.

يتم إنتاج cDNA أيضًا بشكل طبيعي عن طريق الفيروسات القهقرية (مثل HIV-1 و HIV-2 وفيروس نقص المناعة القرد ، وما إلى ذلك) ثم يتم دمجه في جينوم المضيف ، حيث ينتج فيروسًا طاهرًا. [1]

المصطلح كدنا يستخدم أيضًا ، عادةً في سياق المعلوماتية الحيوية ، للإشارة إلى تسلسل نسخة mRNA ، معبرًا عنه كقواعد DNA (deoxy-GCAT) بدلاً من قواعد RNA (GCAU).


بوليميراز الحمض النووي بدائية النواة

في بدائيات النوى ، DNA pol-I و II و III هي الأنواع الثلاثة المهمة التي سنناقشها أدناه.

بوليميريز الحمض النووي أنا

إنه أول إنزيم بوليميراز ، اكتشفه آرثر كورنبرغ في عام 1958. ويتكون من سلسلة واحدة متعددة الببتيد. في البداية ، كان يعتقد أن DNA pol-I هو إنزيم تكرار. في دراسة أخرى ، ثبت أنه إنزيم لإصلاح الحمض النووي أكثر من إنزيم النسخ المتماثل. في pol-I ، توجد ذرة واحدة من الزنك في كل سلسلة ، والتي تُعرف أيضًا باسم "الإنزيمات الفلزية”.

أنشطة DNA pol-I: يُظهر كلاً من البوليميراز وكذلك نشاط نوكلياز خارجي.

  • 5'-3 'نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.
  • 5’-3 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف بادئات الحمض النووي الريبي من الجزء الخامس من خيط DNA التكميلي.

بنية: هيكل Pol-I يشبه اليد اليمنى للإنسان. يتكون الهيكل من المناطق الثلاث التالية:

  • منطقة النخيل: هو الموقع النشط الحفزي الذي يمتلك تسلسلات محفوظة. إنه بمثابة موقع نشط لـ pol-I. منطقة النخيل مصنوعة من صفائح مطوية. وتتمثل وظيفتها الأساسية في معالجة إضافة ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد.
  • منطقة الاصبع: إنه موقع القالب ، حيث بمجرد الانتهاء من الاقتران الأساسي فإنه يرفق ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد. وتتمثل وظيفتها الأساسية في تحفيز تخليق النيوكليوتيدات الواردة بمساعدة محفز يعرف باسم أيونات المعادن.
  • منطقة الإبهام: هي المنطقة التي تربط الحمض النووي وتحافظ على الموضع الصحيح للبرايمر والموقع النشط.


بوليميريز DNA II

اكتشفه توماس كورنبرغ في عام 1970. وكفاءته في البلمرة أبطأ من pol-I. يتكون أيضًا من سلسلة عديد ببتيد واحدة. Pol-II بمثابة انزيم احتياطي أو بديل لعملية التكرار ، لأنه في حالة عدم وجود pol-I يمكن أن يطيل شظايا Okazaki.

أنشطة DNA pol-II:

  • 5’-3 ’نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.

بنية: هيكل pol-II غير معروف تمامًا.

بوليميريز الحمض النووي الثالث

إنه الإنزيم الأساسي الذي يشارك بشكل أساسي في عملية النسخ المتماثل. يتكون من سلسلتين عديد الببتيد. يحتوي Pol-III على وحدة فرعية من العديد من الإنزيمات التي تؤدي وظائف مختلفة ، وتسمى أيضًا "إنزيم غير متجانس". يحتوي Pol-III على 10 وحدات فرعية في بنيته تجعل من pol-III إنزيمًا كاملاً ، أي "holoenzyme".

الأنشطة الموجودة في DNA pol-III:

  • 5'-3 'نشاط البلمرة يتضمن إضافة قواعد النوكليوتيدات لتركيب خيط DNA جديد.
  • 3’-5 ’نشاط نوكلياز خارجي يتضمن حذف قواعد النوكليوتيدات غير المتطابقة أو يساعد في ترجمة نيك.

بنية: يتكون هيكل pol-III من 10 وحدات فرعية ، مثل:

  • α: يشفر جين DNA E ويساعد في تخليق الحمض النووي.
  • Ɛ: رموز لجين DNA Q وتساعد في نشاط التدقيق اللغوي 3’-5.
  • Ɵ: يشفر جين hol E ، ويعمل كبروتين ملحق ويشارك أيضًا في آلية التدقيق اللغوي.
  • Ʈ: يرمز لجين DNA X ويعزز إضعاف مركب البروتين الأساسي.
  • Ƴ: يرمز لجين DNA Y.
  • δ: يشفر الجين A.
  • δ ': رموز لجين هول ب.
  • χ: لتشفير جين هول سي.
  • Ψ: رموز لجين هول D.
  • β: يشفر الجين DNA N. إنه بمثابة بروتين المشبك الذي يحمل جزيء الحمض النووي والمسؤول عن عامل التصنيع. Ƴ و δ و δ 'و χ و كلها تعمل كمركب محمل مشابك وتساعد β- بروتين محمل المشبك على الارتباط بالحمض النووي.

مخطط المقارنة بين وظائف بدائية النواة DNA Polymerases

الخصائصDNA pol-IDNA pol- IIDNA pol-III
5’-3 ’نشاط البلمرةالحاليالحاليالحالي
3’-5 ’نوكلياز خارجيالحاليالحاليالحالي
5’-3 ’نشاط نوكلياز خارجيالحاليغائبغائب
البلمرة المعتمدة على الحمض النووي الريبييمكن أن تنفذ البلمرة المعتمدة على الحمض النووي الريبيلا تستطيعلا تستطيع
خصائص إصلاح الحمض النوويالحاليالحاليغائب
خاصية الربطالحاليغائبغائب
المشاركة في التكراريشارك لا تشاركيلعب دورًا رئيسيًا

مميزات

يحتوي DNA- polymerase على بعض الخصائص المحددة مثل:

  1. نشاط البلمرة
  2. الاخلاص، أي القدرة على التصحيح اللغوي
  3. العملية، أي معالجة الحمض النووي وأسسه
  4. ثبات الحرارة، أي الاستقرار عند درجة حرارة عالية
    مثال: Taq- DNA polymerase of ترمس البكتيريا المائية.

كل هذه الخصائص تجعلها مفيدة في التقنيات الجزيئية مثل PCR وتسلسل الحمض النووي وما إلى ذلك.


استطالة النسخ المتماثل

بعد "إطلاق" الأصل ، تبدأ هيليكاز بفك حلزون الحمض النووي ويحدث تجميع آلية النسخ المتماثل. حيث يتم فك حلزون الحمض النووي يسمى الهليكس شوكة النسخ المتماثل . تشارك البروتينات التالية في تكرار الحمض النووي وستتم مناقشتها في هذا القسم: Helicase و DNA primase و DNA polymerases α و و و PCNA و FEN-1 و RNase H2.

إن بوليميرات الدنا غير قادرة على صنع خيط جديد من الدنا بدون تسلسل قصير للحمض النووي يسمى التمهيدي الذي يمكن أن يوفر مجموعة 3-هيدروكسيل مجانية. بدلاً من ذلك ، أثناء النسخ ، يمكن أن تربط بوليمرات الحمض النووي الريبي جزيئات الحمض النووي أحادية السلسلة ، و "قراءة" تسلسل الحمض النووي ، والبدء فورًا في بناء جزيء الحمض النووي الريبي. لأن RNA polymerases يمكنها تصنيع الأحماض النووية من جديد يسمى بوليميراز الحمض النووي الريبي الحمض النووي بريماز يربط الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل ويضيف قصيرًا (

35 nt) تسلسل الحمض النووي الريبي على كل من خيوط DNA القالب على جانبي أصل النسخ المتماثل (الشكل 14-2 A & amp B). ثم يمكن أن تبدأ بوليميرات الحمض النووي في تركيب جزيئات الحمض النووي (الشكل 14-2 ب). ثم يتم تضمين ثلاثة أنواع رئيسية من بلمرة الحمض النووي: α و و ε. يضيف DNA pol α جزءًا قصيرًا (من 20 إلى 30 nts) من DNA إلى RNA التمهيدي على كلا الخيوط ، ثم يسلم التخليق إلى بوليميريز ثاني إما DNA pol أو DNA pol. بروتين يسمى تكاثر مستضد الخلية النووية (PCNA) "مشابك" حول الحمض النووي وتتفاعل مع البوليميراز للمساعدة في استقرار تفاعل البوليميراز مع الحمض النووي والحفاظ عليه. سيستمر تكرار الحمض النووي في كلا الاتجاهين ، بعيدًا عن الأصل.

الشكل 14-2: بداية تكرار الحمض النووي. (أ) بعد أن يبدأ الهليكاز (المثلث الأرجواني) في فك الحمض النووي في الأصل ، يمكن أن يتعرف DNA primase (الصندوق الوردي) على الحمض النووي أحادي الجديلة ويبدأ في إضافة مادة أولية قصيرة من الحمض النووي الريبي (كما هو موضح في B). لاحظ أنه من المقدر أن يضيف DNA primase حوالي 35 نيوكليوتيدات RNA. يمثل هذا الرسم التوضيحي هذه الإضافة باستخدام 2 نيوكليوتيدات فقط (العنصر الرئيسي الوردي - كل خط عمودي هو نيوكليوتيد واحد). سيضيف بوليميراز الدنا (باللون الأزرق) α نيوكليوتيدات إلى نهاية 3’-أوه من التمهيدي ثم "يسلم" البلمرة إما إلى بوليميريز الحمض النووي δ أو بوليميريز الحمض النووي ε. تحدث البلمرة على الخصلة البنت في اتجاه 5 إلى 3. في الخيط الأبوي العلوي ، هذا يعني أن البلمرة ستحدث من اليمين إلى اليسار ، وفي الخصلة الأبوية السفلية ستحدث من اليسار إلى اليمين. PCNA (الحلقة البرتقالية) هو بروتين يساعد في الحفاظ على بوليميريز الحمض النووي المرتبط بقالب الحمض النووي. (رسم كريستوفر ج.براون)

لاحظ في الشكل 14-2B أن جميع بوليمرات الحمض النووي ترتبط بمجموعة 3’-OH على أساس الحمض النووي الريبي لبدء تكرار الحمض النووي.

نظرًا لاستطالة بوليميرات الحمض النووي من مادة RNA التمهيدي (الشكل 14-3) ، ستلاحظ أن بوليميرات الحمض النووي ذات اللون الأزرق الداكن يمكنها تكرار خيوط الابنة دون "الاصطدام" ببنية أخرى. وطالما استمرت الهليكاز في فك حلزون الحمض النووي ، يمكن لمركب البوليميراز هذا المضي قدمًا في اتجاه 5 "إلى 3" دون توقف. يتم تصنيع خيوط الابنة التي يتم تصنيعها في نفس الاتجاه الذي تتقدم فيه شوكة النسخ بطريقة مستمرة ويطلق عليها خيوط رائدة . وبدلاً من ذلك ، فإن بوليميرات الحمض النووي التي يمثلها اللون الأزرق الفاتح سوف "تصطدم" ببادئ الحمض النووي الريبي السابق. لا يزال يتم تكرار هذه الخيوط الابنة من 5 إلى 3 "ولكن لا يتم تكرارها في نفس اتجاه شوكة النسخ الأقرب لها ويتم تكرارها في أجزاء أقصر. هذا الخيط الابنة يسمى حبلا متخلفة .

الشكل 14-3: استطالة جزء تكرار الحمض النووي 2 . تكرر بوليميرات الحمض النووي باللون الأزرق الداكن (α و) الحمض النووي في نفس الاتجاه الذي تتحرك فيه شوكة النسخ ، ويسمى تخليق الخيط الرئيسي. تقوم بوليميرات الحمض النووي باللون الأزرق الفاتح (α و) بتكرار الحمض النووي بعيدًا عن أقرب شوكة تكرار لها في أجزاء قصيرة ، تسمى تخليق الخيوط المتأخرة. سوف "تصطدم" بوليمرات الجدائل المتخلفة ببادئات الحمض النووي الريبي المجاورة. لاحظ عودة DNA primase (الصندوق الوردي) ، والتي يجب أن تعود إلى الخيط المتأخر لوضع برايمر جديد بحيث يكون 3’OH جديد متاحًا للنسخ المتماثل. (رسم كريستوفر ج.براون)

بمجرد "ارتطام" مركب البوليميراز المتأخر في جزيء الحمض النووي الريبي المجاور ، سيبدأ في إزاحة الجار عن طريق "تقشير" النيوكليوتيدات وإعادة تكرار هذا الجزء من الحمض النووي (الشكل 14-4 أ). يتسبب التقشير الخلفي في تكوين "سديلة" صغيرة ، وتأتي إنزيمات خاصة تسمى نوكليازات داخلية تقطع العمود الفقري للفوسفوديستر بالقرب من حدود الحمض النووي الريبي / الحمض النووي. يسمى الإنزيمان اللذان يعتقد أنهما المسؤولان الأكبر عن هذا الإجراء RNase H2 و FEN-1 (نوكلياز داخلي رفرف 1). بمجرد إزالة السديلة ، سوف تملأ بوليمرات الشريط المتأخرة أي تسلسل DNA متبقي. ثم ينفصل عن الحمض النووي ويترك "شقًا" في العمود الفقري للحمض النووي. سيقوم إنزيم يسمى DNA ligase بربط وربط 3’-OH كيميائياً مع مجموعة 5’-فوسفات الحرة "ختم" العمود الفقري (الشكل 14-4 ب).

الشكل 14-4: عملية إزالة بادئات RNA وربط خيوط DNA. (أ) ستعمل بوليمرات الحمض النووي المتخلفة في بادئات الحمض النووي الريبي المجاورة ، وتزيحها ، وستقوم نوكليازات الرفرفة الداخلية (RNase H2 و FEN-1-teal PacMan ™) بإزالتها. ستقوم بوليميرات الحمض النووي بتكرار أي نيوكليوتيدات متبقية ثم تنفصل مع الحمض النووي تاركًا العمود الفقري المكسور. (ب) سيقوم DNA Ligase (كما هو موضح في تان) بتوصيل مجموعات 3’-hydroxyl و 5’-phosphate لإصلاح العمود الفقري المكسور. تسمى شظايا الحمض النووي الريبي / الحمض النووي القصيرة المتولدة على الخيط المتأخر شظايا أوكازاكي. (رسم كريستوفر ج.براون)

بتكرار هذه العملية على الشريط المتأخر ، فإن شظايا الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الصغيرة (تسمى شظايا أوكازاكي ) معًا لجعل خيطًا طويلًا من الحمض النووي خاليًا من أي نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي (الشكل 14-5).

بحلول نهاية المرحلة S ، ستكون الخلية قد قامت بتكرار الجينوم بأكمله بشكل كامل وأمين. دعونا نفكر في كروموسوم واحد للحظة. قبل المرحلة S ، يتكون الكروموسوم الفردي من خيطي DNA ، يتم ربطهما معًا بواسطة روابط هيدروجينية في حلزون DNA واحد. بحلول نهاية المرحلة S ، يتكون الكروموسوم من أربعة خيوط من الحمض النووي تنقسم بالتساوي بين بنيتين متطابقتين تسمى الكروماتيدات. لأن الكروماتيدات متطابقة ، يتم استدعاؤها الكروماتيدات الشقيقة. كيف تجمع هؤلاء الأخوات معًا؟ ليست الهيدروجين مرتبطة ببعضها البعض مثل الحلزونات الفردية ، بدلاً من ذلك بروتين خاص يسمى cohesin حرفيا "يربط" الكروماتيدات الشقيقة معًا. يظل Cohesin مرتبطًا بكل من الكروماتيدات الشقيقة حتى المرحلة M عندما يسمى إنزيم خاص فصل يحط من شأنه ، مما يسمح للأخوات بالانفصال. لمزيد من المعلومات التفصيلية ، ارجع إلى الفصل 13.

الشكل 14-5: الإزالة المتكررة لبادئات الحمض النووي الريبي وعمل الليجاز. (أ) تستمر الدورة من الشكل 14-4 حتى يتم تكرار كلا الخيوط الأبوية للحمض النووي. (ب) لاحظ مع استمرار هذه العملية ، أصبحت خصلة الابنة قطعة واحدة طويلة من الحمض النووي. ستتم إزالة البادئات النهائية للحمض النووي الريبي في نهايات الخيط المتأخر في عملية مختلفة (لم تتم مناقشتها هنا). (رسم كريستوفر ج.براون)

يتم الاحتفاظ بالنمذجة اللاجينية بعد النسخ المتماثل

يمكن إضافة مجموعات الميثيل إلى نيوكليوتيدات السيتوزين كآلية للتحكم في الجينات التي يتم نسخها في الخلايا ، وهو شكل من أشكال الزخرفة اللاجينية. غالبًا ما يكون هذا مهمًا في هوية الخلية وعملها السليم. لذلك ، من المهم التأكد من الاحتفاظ بأي نمط جيني بعد التكرار في حبلا الابنة. نظرًا لأن السيتوزينات في السلاسل الأبوية ستحتفظ بأي مثيلة ، فإن ميثيل ترانسفيرازات الحمض النووي التي تتعرف على مثيلة الخيط الأبوي ستكون قادرة على ميثيل السيتوزينات المناسبة في حبلا الابنة. راجع الشكل 5-8 في الفصل 5 للربط بين هذه الأفكار.

أخطاء في تكرار الحمض النووي وتصحيح التجارب المطبعية

يعد تكرار الحمض النووي عملية دقيقة للغاية ، ولكن يمكن أن تحدث أخطاء في بعض الأحيان ، مثل إدخال بوليميراز الحمض النووي قاعدة خاطئة.

يتم تصحيح معظم الأخطاء أثناء تكرار الحمض النووي على الفور من خلال القدرة على التدقيق اللغوي لبوليميراز الحمض النووي نفسه (الشكل 14-6). في عملية التدقيق اللغوي ، يقرأ بولد الدنا δ أو القاعدة المضافة حديثًا قبل إضافة القاعدة التالية ، لذلك يمكن إجراء التصحيح. يتحقق البوليميراز مما إذا كانت القاعدة المضافة حديثًا قد تم إقرانها بشكل صحيح مع القاعدة الموجودة في حبلا القالب. إذا كانت القاعدة الصحيحة ، يضاف النيوكليوتيد التالي. إذا تمت إضافة قاعدة غير صحيحة ، يقوم الإنزيم بعمل قطع في رابطة الفوسفوديستر ويطلق النيوكليوتيد الخاطئ على حبلا الابنة. يتم تنفيذ ذلك من خلال عمل نوكلياز خارجي 3 & # x27 لـ DNA pol δ أو ε. بمجرد إزالة النيوكليوتيد غير الصحيح ، يمكن استبداله بالنيوكليوتيد الصحيح. لاحظ أن DNA pol α ليس لديه القدرة على التدقيق اللغوي لأنه لا يحتوي على نشاط نوكلياز خارجي 3.

الشكل 14-6: التدقيق اللغوي بواسطة بوليميراز الحمض النووي. تحتوي دلتا بوليميراز الدنا وإبسيلون على إنزيم نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 بوصات يسمح بإزالة النيوكليوتيدات المقترنة بشكل غير صحيح (NT). يتعرف الإنزيم على عدم التطابق ، ويبطئ للسماح للنوكلياز الخارجي من 3 إلى 5 بالتفاعل مع nt المقترن بشكل غير صحيح. إنه يشق العمود الفقري لحبلة الابنة لإزالة القاعدة الخاطئة ثم تضيف آلية النسخ "5 إلى 3" النيوكليوتيد الصحيح. (رسم توضيحي لجينيل تالي.)


ما هو بوليميريز الحمض النووي الذي يمكن أن يستخدم النك كموقع فتيلة؟ - مادة الاحياء

تكرار الحمض النووي هو عملية شبه محافظة تحدث أثناء المرحلة S من الطور البيني. إنها العملية التي يتم من خلالها نسخ الحمض النووي للكائن الحي لإنتاج نسختين متطابقتين.

يبدأ من أصل التكرار. بدائيات النوى لها أصل واحد للنسخ المتماثل ، في حين أن حقيقيات النوى لها أصل متعدد. في كل أصل للنسخ المتماثل ، توجد فقاعة نسخ تحتوي على شوكتي نسخ متماثل. في كل شوكة نسخ يوجد إنزيم هليكاز DNA الذي يفسد البنية الحلزونية المزدوجة للحمض النووي. يقوم بذلك عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد النيتروجينية ، وفصل خيوط الحمض النووي. تمنع بروتينات ربط الخيط المفرد الخيوط المنفصلة من إعادة الربط عند شوكة النسخ المتماثل. تسمى الآن خيوط الحمض النووي المنفصلة خيوط القالب.

إن إنزيم DNA polymerase III هو الإنزيم الذي يستخدم لبناء خيط DNA مكمل باستخدام حبلا قالب. يقوم بذلك عن طريق ربط nucleoside triphosphates بالطرف 3 من nucleotide. يضمن بوليميراز الحمض النووي III أيضًا أن النيوكليوتيدات التي يتم إرفاقها لها قواعد تكميلية لقالب القالب. ومع ذلك ، لا يمكن أن يضيف DNA polymerase III نيوكليوتيدات إلى حبلا القالب. لذا فإن RNA primase يخلق بادئات RNA: تسلسلات قصيرة من RNA تكون مكملة لشريط قالب DNA. يحتوي DNA polymerase III على 3 نهايات متاحة لإضافة النيوكليوتيدات إليها. ومع ذلك ، يمكن لـ DNA polymerase III القيام بذلك فقط في اتجاه 5 "إلى 3".

الحمض النووي غير متوازي أي أن كل خيط يسير في الاتجاه المعاكس (كما هو موضح في الرسم البياني أدناه).

وبسبب هذا ، فإن خيوط القالب هي أيضًا في اتجاهات مختلفة. في الرسم البياني أعلاه ، سيكون الخيط الموجود على اليمين هو الخيط الرئيسي. هذا يعني أنه بعد وضع أساس RNA في الطرف الثالث من هذا الخيط ، يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يبني الخيط التكميلي باستمرار في اتجاه 5 "إلى 3".

الخيط الموجود على يمين المخطط هو الخيط المتأخر. يبدو أن الخصلة المتأخرة تنمو في اتجاه 3 إلى 5 ، ولكن هذا ليس هو الحال. ينقسم الخيط المتأخر إلى أجزاء تسمى شظايا Okazaki التي يتم بناؤها بشكل فردي في اتجاه 5 "إلى 3" بواسطة DNA polymerase III. يبدأ كل جزء ببادئ RNA. عندما تقوم هيليكس بفك ضغط الحلزون المزدوج للحمض النووي ، تتم إضافة المزيد والمزيد من البادئات.

تشارك إنزيمات أخرى في تكرار الحمض النووي أيضًا. يزيل DNA polymerase I بادئات RNA ويستبدلها بنكليوتيدات DNA. يشكل DNA ligase روابط phosphodiester بين نيوكليوتيدات DNA التي يضيفها DNA polymerase I ونهايات شظايا Okazaki. أخيرًا ، تصحح الإنزيمات خيوط الحمض النووي للتحقق من الأخطاء ، ومنع الطفرات.

7.1.1 النيوكليوسومات تساعد على لفائف الحمض النووي.

تساعد النيوكليوسومات أيضًا في تنظيم التعبير الجيني. يتم لف بعض الحمض النووي حول الهستونات في النواة ولا يمكن الوصول إليها بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي ، لذلك لا يمكن نسخها

فيديو يوتيوب

اقترح 7.1.2 بنية الحمض النووي آلية لتكرار الحمض النووي.

الحمض النووي مزدوج الجديلة ويتم ربط الخيوط معًا عبر الاقتران الأساسي التكميلي. لذلك ، من المنطقي أنه أثناء النسخ المتماثل ، ينفصل الخيطان ومن ثم ينضم من خلال النوكليوتيدات المتزاوجة القاعدية التكميلية إلى الخيوط المنفصلة. وهذا من شأنه أن يصنع خيطين جديدين متطابقين من الحمض النووي.

7.1.3 يمكن أن تضيف بوليميرات الحمض النووي فقط النيوكليوتيدات إلى الطرف 3 من التمهيدي.

لا يمكن لبوليميراز الحمض النووي أن يضيف روابط إلى الفوسفات على الطرف 5 'من الحمض النووي ، لذلك فإنه ينشئ روابط على الطرف 3.

7.1.4 تكرار الحمض النووي مستمر على الخيط الرئيسي وغير مستمر على الخيط المتأخر.

يحدث تكرار الحمض النووي على كل من خيطي الحمض النووي ، أحدهما يسمى الشريط الرئيسي والآخر يسمى المتأخر. الشريط الأمامي هو الذي يتحرك في اتجاه 3 إلى 5 بنفس الطريقة التي تتحرك بها الهليكاز.

7.1.5 يتم إجراء تكرار الحمض النووي بواسطة نظام معقد من الإنزيمات.

بوليميراز الحمض النووي III - يحفز التفاعل الذي يربط النيوكليوتيدات الحرة العائمة لصنع حبلا DNA جديد

Helicase - يفصل خيوط الحمض النووي الأصلية

Gyrase / Topoisomerase - يساعد على فك حلزون الحمض النووي

بريماز DNA - يوفر موقعًا يسمى Primase لـ DNA polymerase III لبدء إضافة النيوكليوتيدات.

DNA Polymerase I - يستبدل الحمض النووي الريبي التمهيدي بالحمض النووي

بروتينات ربط حبلا أحادية - تمنع الحمض النووي من إعادة التلدين

Ligase - ينضم إلى شظايا أوكازاكي معًا

7.1.6 بعض مناطق الدنا لا ترمز للبروتينات ولكن لها وظائف أخرى مهمة.

يشار إلى الحمض النووي الذي لا يرمز إلى بروتين على أنه تسلسل غير مشفر. بعض التسلسلات غير المشفرة لها وظائف مهمة مثل تنظيم التعبير الجيني عن طريق تعزيز وقمع نسخ الجينات المجاورة لـ.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم مقاطعة العديد من تسلسلات تشفير الحمض النووي بواسطة تسلسلات غير مشفرة تسمى الإنترونات. تتم إزالة الإنترونات قبل الترجمة ولكنها مهمة في معالجة الرنا المرسال

في نهايات الكروموسومات توجد تسلسلات غير مشفرة تسمى التيلوميرات. أثناء تكرار الحمض النووي ، لا يمكن تكرار نهاية الجزيء ، لذا فإن التيلوميرات تحمي أجزاء من الحمض النووي من الضياع أثناء التكاثر

أخيرًا ، ترمز بعض التسلسلات غير المشفرة لجزيئات الحمض النووي الريبي بدلاً من البروتين.


7.1.7 تحقيق روزاليند فرانكلين وموريس ويلكنز لبنية الحمض النووي عن طريق حيود الأشعة السينية.

في عام 1950 ، طور Marice Wilkins طريقة لإنتاج طريقة لتصوير جزيء الحمض النووي من خلال حيود الأشعة السينية. عملت روزاليند فرانكلين في نفس المختبر مع ويلكينز وطوّرت كاشفًا عالي الدقة يلتقط صورًا واضحة جدًا للحمض النووي. كانت النتائج التي توصلت إليها ضرورية في اكتشاف الحلزون المزدوج بواسطة كريك وواتسون

7.1.8 استخدام النيوكليوتيدات المحتوية على حمض ثنائي أوكسي ريبونوكليك لوقف تكاثر الحمض النووي في تحضير العينات لتسلسل القاعدة.

تسلسل الحمض النووي هو عملية يمكن من خلالها العثور على ترتيب النيوكليوتيدات في الحمض النووي. تتمثل إحدى الخطوات الأولية لتسلسل الحمض النووي في تفتيت الحمض النووي إلى أجزاء. للقيام بهذا الحمض النووي يضاف (dideoxyribonucleic acid) الذي لا يحتوي على جزيء OH في نهاية 3 'من سكر الريبوز ، وهذا يعني أنه عندما يصل بوليميريز DNA إلى ddNA فإنه لا يمكنه الاستمرار في التكاثر.

الرحلان الكهربائي للهلام هو العملية التي يتم من خلالها العثور على تسلسل الحمض النووي. يتم وضع الحمض النووي المجزأ في مادة هلامية ويمر عبره تيار كهربائي. الحمض النووي هو جزيء قطبي ويتأثر بالتيار الكهربائي ويتحرك إلى أسفل الهلام. تتحرك الأجزاء الأخف / الأصغر من الحمض النووي أكثر بينما تتحرك الأجزاء الأثقل / الأطول قليلاً جدًا. والنتيجة هي نمط من العصابات التي يمكن للمرء استخدامها لمعرفة تسلسل الحمض النووي. لكن تذكر أن تسلسل الخيط الأصلي مكمل للتسلسل الذي تظهره أنماط النطاقات منذ أن تكاثر الحمض النووي.


7.1.9 تستخدم التكرارات الترادفية في توصيف الحمض النووي.

التكرار الترادفي للعدد المتغير (VNTR) هو عبارة عن سلسلة قصيرة من النيوكليوتيدات التي يمكن استخدامها لإنشاء ملف تعريف لشخص بناءً على عدد مرات تكرار التسلسل. تم العثور على VNTR في نفس المكان (الموقع على الكروموسوم) بين مختلف الأشخاص مما يجعل العثور عليه سهلًا نسبيًا. يمكن استخدام توصيف الحمض النووي لحل القضايا الجنائية وحل النزاعات الأبوية من بين أمور أخرى


7.1.10 تحليل نتائج تجربة هيرشي وتشيس يقدم دليلاً على أن الحمض النووي هو المادة الجينية.

أجرى هيرشي وتشيس تجربة لمعرفة ما إذا كانت البروتينات أو الحمض النووي هي المادة الوراثية للخلية. للقيام بذلك ، قاموا بإصابة بكتيريا الإشريكية القولونية بفيروس T2 Phage. تتكون الفيروسات من الحمض النووي فقط داخل غلاف بروتيني لذلك لم تكن هناك متغيرات أخرى في المزيج.

يحتوي الحمض النووي على الفوسفور ولكن لا يحتوي على الكبريت ، ويمكن أن تحتوي البروتينات على الكبريت وليس الفوسفور. تم استخدام هذا التمييز في التجربة باستخدام نظائر (أشكال مختلفة) للكبريت والفوسفور. لقد صنعوا سلالتين من بكتيريا T2 Phage ، إحداهما تحتوي على نظير فوسفور أثقل في الحمض النووي ، والأخرى بنظير كبريت أثقل في البروتينات. لقد فعلوا ذلك عن طريق وضع T2 في محلول مع كل ما يلزم للتكرار وفقط النسخة الأثقل من الكبريت أو النسخة الأثقل من الفوسفور. بعد تكرار فجوة T2 عدة مرات ، ستتكون في الغالب من نظير أثقل

تسبب هيرشي وتشيس في قيام الفيروس T2 بحقن مادته الجينية في بكتيريا الإشريكية القولونية. وبعد ذلك وضعوا الإشريكية القولونية في أنبوب اختبار ووضعوا أنبوب الاختبار هذا في جهاز طرد مركزي لتدويره بسرعة كبيرة في دائرة. بسبب الحركة الدائرية السريعة ، تحركت الأجزاء الثقيلة من E. Coli إلى أسفل أنبوب الاختبار بينما كانت النظائر الأخف في الأعلى.

عندما حقنت سلالة الكبريت مادتها الجينية ، كانت النسبة المئوية للنظائر الثقيلة مقابل النظائر الخفيفة ضئيلة. ومع ذلك ، عندما حقنت سلالة الفوسفور من الفيروس مادتها الوراثية في البكتيريا ، كان 65٪ من الحمض النووي في بكتيريا E. Coli من النظير الثقيل بناءً على نتائج أجهزة الطرد المركزي.


مناقشة

من خلال استخدام تقنية التسلسل من الجيل التالي ، قيمت الدراسة الحالية تفضيل البوليميراز من خلال الملاحظة المباشرة لكفاءة التهيئة لجميع البادئات السداسية الممكنة. التركيب البلوري للنشاط الحفاز Bacillus stearothermophilus تشير بلورات بوليميراز الدنا إلى أن ما يقرب من عشرة نقاط أساس من البادئة: قالب DNA مزدوج وأربعة نيوكليوتيدات للقالب أمام تقاطع قالب التمهيدي تشغل موقع ربط الحمض النووي للبوليميراز أثناء التخليق [7 ، 9]. بالإضافة إلى ذلك ، يكشف الهيكل عن انتقال من الحمض النووي للنموذج A إلى B في ست نقاط أساس متجاورة مع التمهيدي: تقاطع القالب. ميل تسلسل نيوكليوتيد معين نحو التشكل A أو B هو عامل رئيسي في العديد من تفاعلات البروتين والحمض النووي [10 ، 11]. على سبيل المثال ، عندما يرتبط بروتين مستقبل AMP الدوري ، يخضع الحمض النووي للانتقال من B إلى A ، ويكون الارتباط أقوى عندما يكون الجزء المركزي من الحمض النووي في الشكل A [12]. على غرار بوليميراز الحمض النووي ، تشكلت مضاعفات الحمض النووي الريبي-الحمض النووي بشكل عابر أثناء النسخ [13] والحمض النووي في المراكز النشطة للنسخة العكسية لفيروس HIV-1 [14] أيضًا في الشكل أ. لقد تم اقتراح أن تثبيت الشكل A قد يكون حاسمًا لزيادة دقة تخليق DNA و RNA [15]. في هذه الدراسة ، لاحظنا أن الزوجين الأساسيين الموجودين في التمهيدي: تقاطع القالب يحتوي على محتوى GC عالي في تسلسلات تم تضخيمها بشكل تفضيلي. أظهر العديد من المؤلفين أن بولي (dG) -poly (dC) يخضع للانتقال من الشكل B إلى الشكل A من بولي (dA) -poly (dT) بسهولة أكبر ، والذي يميل إلى مقاومة الانتقال من B إلى A [12 ، 16] . في الواقع ، فإن الطاقة الحرة لـ Gibb للانتقال من B إلى A للزخارف الثلاثية الغنية بالـ GC أقل من انتقال أشكال متسلسلة غنية مماثلة لـ AT [16]. من المعقول اعتبار أن التمهيدي: تفاعل القالب الذي يميل إلى أن يكون من النموذج A أو التمهيدي: تفاعل القالب الذي يمكن أن يتوافق بسهولة أكبر مع النموذج A مرتبط بشكل تفضيلي ببوليميراز الحمض النووي ، مما يؤدي في النهاية إلى تضخيم متحيز .

كان الغرض من الدراسة الحالية هو إظهار وتعريف التحيز الأساسي المعتمد على بوليميريز الحمض النووي. لوحظ تحيز التضخيم الإيجابي نحو زيادة محتوى GC للأزواج الأساسية الستة من التمهيدي: تفاعل القالب لجميع بوليمرات الحمض النووي التجارية التي تم اختبارها ، وتم تحديد العديد من أشكال التسلسل المضخم بشكل تفضيلي. ومن المثير للاهتمام أن Dabney et al. وجد أن بعض البوليميرات شائعة الاستخدام تحيز بشدة ضد تضخيم الحمض النووي الداخلي لصالح التلوث الجرثومي الغني بالـ GC [5]. في دراستهم ، أظهر Phusion HF و AmpliTaq Gold تحيزًا واضحًا جدًا تجاه الجزيئات ذات gt50٪ GC. دراسة أخرى بواسطة Hansen et al. أظهر أن تحضير السداسي العشوائي أثناء توليد (كدنا) يحث على التحيزات في بداية قراءة تسلسل النيوكليوتيدات. في دراستهم ، حاولوا تمييز ما إذا كانت قراءات التسلسل عالية الإنتاجية قد نشأت من خيط الإحساس عن طريق تخليق الخيط الثاني (من بوليميريز الحمض النووي) أو الخيط المضاد عن طريق تخليق الشريطة الأولى (من النسخ العكسي) [6]. نظرًا لأن كلا الخيطين أظهروا نمط تحيز مشابه ، فقد استنتجوا أن تخليق DNA الخيط الثاني من المحتمل أن يتم تحضيره بواسطة السداسيات العشوائية المتبقية في المحلول. كما لاحظوا اختلافات طفيفة في الأنماط في خيوط المعنى ومضادات المعنى والتي نسبوها إلى خصائص التسلسل المختلفة للنسخة العكسية وبوليميراز الحمض النووي أو تأثير تحضير النك [6]. تتوافق بياناتنا مع استنتاجهم وتشير إلى أن غالبية التحيز من المحتمل أن يكون ناتجًا عن التحضير بواسطة السداسيات العشوائية وتفضيل بوليميراز الحمض النووي لبعض التمهيدي: تقاطعات القالب. قد يكون للنسخة العكسية أيضًا أشكال تسلسل تفضيلية حيث أن مضاعف RNA-DNA في المركز النشط للنسخة العكسية HIV-1 [14] هو من الشكل A ومع ذلك ، لم يتم تناول تحيز النسخ العكسي في التجارب الموصوفة حاليًا.

في دراستنا ، كانت الأزواج الأربعة الأساسية لقالب الحمض النووي المفرد الذي يتبع التقاطع مباشرة ، والتي أطلقنا عليها اسم "المدرج" ، موضع اهتمام أيضًا لأن البوليميراز يمكن أن يتفاعل مباشرة مع القواعد المكشوفة للقالب المفرد الذي تقطعت به السبل. يمكن أن يؤثر هذا التفاعل على التضخيم. على سبيل المثال ، في بوليميراز الدنا للعائلة البدائية B ، يمتلك بوليميراز الدنا وظيفة قراءة مسبقة حيث تتوقف البلمرة إذا تمت مصادفة اليوراسيل 4 أزواج قاعدية قبل التمهيدي: تقاطع القالب [17 ، 18]. لا يتم ملاحظة ذلك مع بوليميرات الحمض النووي من العائلة. لم يكن لتسلسل المدرج في التجارب الموصوفة اتجاه محدد بوضوح فيما يتعلق بمحتوى GC مثل التمهيدي: تفاعل القالب. ومع ذلك ، كانت درجة معينة من التحيز واضحة ، وتمكنا من تحديد الأشكال المتسلسلة التي تم تضخيمها بشكل تفضيلي. يشير هذا إلى أنه عند تضخيم الأهداف باستخدام الاشعال الشامل ، كما هو الحال في بعض تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال ، يجب توخي الحذر للتأكد من أن تقاطع القالب التمهيدي مشابه لجميع الأهداف. إذا كان التمهيدي: تقاطع القالب يختلف قبل التقاطع ، فقد يؤدي ذلك إلى تضخيم بوليميريز DNA بشكل تفضيلي التمهيدي "المفضل": تقاطعات القالب على الآخرين.

في هذا العمل ، تم إجراء جميع التجارب باستخدام أنظمة عازلة البوليميراز الخاصة بالمصنعين مباشرة. قد يؤثر تعديل ظروف المخزن المؤقت على تكوين الإنزيم و / أو الحمض النووي ويحقق تضخيمًا ناجحًا ، ومع ذلك ، يمكن تجنب جهد التصميم بعد التمهيدي عن طريق ضبط موضع التمهيدي قليلاً أثناء مرحلة التصميم الأولية. هذا مفيد بشكل خاص عند تصميم الاشعال للتفاعلات المتعددة حيث يكون التوازن بين المواقع ضروريًا لتقليل التعارض بين الاشعال والأهداف. أثناء تصميم البادئات للتفاعلات متعددة الإرسال ، يمكن استخدام برنامج iC-Architect لتحديد بادئات أمامية وعكسية لقيم PPI عالية ومتشابهة نسبيًا لأهداف متعددة أو لتجنب المناطق ذات قيم PPI المنخفضة جدًا. في النهاية ، يحدد البرنامج الاشعال مع الزخارف المفضلة على الطرف 3 'من التمهيدي ، والتي يمكن استخدامها لزيادة معدلات نجاح PCR ، خاصة عند استخدامها بالاقتران مع Tم قياسات.


Phi29 DNA Polymerase

يتم توفير الكواشف التالية مع هذا المنتج:

phi29 DNA Polymerase M0269SVIAL -20 1 × 0.025 مل 10000 وحدة / مل
المخزن المؤقت لتفاعل البلمرة الحمض النووي phi29 B0269SVIAL -20 1 x 1.5 مل 10 X
الألبومين المؤتلف ، درجة البيولوجيا الجزيئية B9200SVIAL -20 1 x 0.6 مل 20 مجم / مل
phi29 DNA Polymerase M0269LVIAL -20 1 × 0.125 مل 10000 وحدة / مل
المخزن المؤقت لتفاعل البلمرة الحمض النووي phi29 B0269SVIAL -20 1 x 1.5 مل 10 X
الألبومين المؤتلف ، درجة البيولوجيا الجزيئية B9200SVIAL -20 1 x 0.6 مل 20 مجم / مل

ميزات التطبيق

  • يتطلب النسخ المتماثل درجة عالية من إزاحة الجدائل و / أو التوليف العملي
  • تكرار عالي الدقة في درجات حرارة معتدلة

تعريف الوحدة

شروط رد الفعل

1X phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer
المكمل مع BSA المنقى
احتضان في 30 درجة مئوية

1X phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer
50 مم تريس- HCl
10 ملي مجكل2
10 مم (NH4)2وبالتالي4
4 مم DTT
(pH 7.5 @ 25 & deg)

التخزين المؤقت

10 ملم تريس- HCl
100 ملي بوكل
1 مم DTT
0.1 مم يدتا
50٪ جلسرين
0.5٪ توين 20
0.5٪ IGEPAL® CA-630
درجة الحموضة 7.4 @ 25 درجة مئوية

تعطيل الحرارة

الوزن الجزيئي الغرامي

5 '- 3' نوكلياز خارجي

3' - 5' Exonuclease

Strand Displacement

Unit Assay Conditions

Companion Products

Materials Sold Separately

  1. The presence of active reducing reagent in the reaction buffer is critical for this enzyme. While the reaction buffer supplied with the enzyme contains DTT, older buffer stocks or stocks that have been repeatedly frozen and thawed should be supplemented with 4 mM DTT to obtain maximal activity.
  2. If stock solutions of lesser concentration are needed, use Diluent F (NEB #B8006).
  1. Blanco, L. and Salas, M. (1984). بروك. ناتل. أكاد. علوم. الولايات المتحدة الأمريكية. 81, 5325-5329.
  2. Blanco. L., et al. (1989). J. بيول. تشيم.. 264, 8935-8940.
  3. Garmendia, C., et al. (1992). J. بيول. تشيم.. 267, 2594-2599.

Product Citation Tool

تحديد

  • M0269S_L_v1_0131412
  • M0269S_L_v1_0131506
  • M0269S_L_v1_0131512
  • M0269S_L_v2_0131606
  • M0269S_L_v2_0131612
  • M0269S_L_v2_0131712
  • M0269L_v2_10014232
  • M0269S_v2_10013602
  • M0269L_v2_10028010
  • M0269L_v2_10032150
  • M0269S_v2_10034467
  • M0269L_v2_10034472
  • M0269L_v2_10042808
  • M0269L_v2_10047143
  • M0269L_v2_10049721
  • M0269S_v2_10051885
  • M0269S_v3_10055099
  • M0269L_v3_10055100
  • M0269S_v3_10058026
  • M0269L_v3_10061055
  • M0269S_v3_10062498
  • M0269S_v3_10065462
  • M0269L_v3_10065461
  • M0269L_v3_10079525
  • M0269L_v3_10082437
  • M0269L_v3_10088096
  • M0269S_v3_10088150
  • M0269L_v3_10091533
  • M0269S_v3_10097974
  • M0269L_v3_10097975
  • M0269L_v3_10106254
  • M0269S_v3_10113084

This product is covered by one or more patents, trademarks and/or copyrights owned or controlled by New England Biolabs, Inc (NEB).

While NEB develops and validates its products for various applications, the use of this product may require the buyer to obtain additional third party intellectual property rights for certain applications.

For more information about commercial rights, please contact NEB's Global Business Development team at [email protected]

This product is intended for research purposes only. This product is not intended to be used for therapeutic or diagnostic purposes in humans or animals.

New England Biolabs (NEB) is committed to practicing ethical science &ndash we believe it is our job as researchers to ask the important questions that when answered will help preserve our quality of life and the world that we live in. However, this research should always be done in safe and ethical manner. يتعلم أكثر.

Licenses

Trademarks

THERMOPOL ® is a registered trademark of New England Biolabs, Inc.

IGEPAL ® is a registered trademark of Rhodia Operations.
TWEEN ® is a registered trademark of Uniqema Americas, LLC.


Steps in DNA Replication

The process of DNA replication is a complex one, and involves a set of proteins and enzymes that collectively assemble nucleotides in the predetermined sequence. In response to the molecular cues received during cell division, these molecules initiate DNA replication, and synthesize two new strands using the existing strands as templates. Each of the two resultant, identical DNA molecules is composed of one old and one new strand of DNA. Hence the process of DNA replication is said to be a semi-conservative one.

The series of events that occur during prokaryotic DNA replication have been explained below.

المبادرة

DNA replication begins at specific site termed as origin of replication, which has a specific sequence that can be recognized by initiator proteins called DnaA. They bind to the DNA molecule at the origin sites, thus flagging it for the docking of other proteins and enzymes essential for DNA replication. An enzyme called helicase is recruited to the site for unwinding the helices into single strands.

هل تود الكتابة لنا؟ حسنًا ، نحن نبحث عن كتاب جيدين يريدون نشر الكلمة. تواصل معنا وسنتحدث.

Helicases break the hydrogen bonds between base pairs, in an energy-dependent manner. This point or region of DNA is now known as the replication fork. Once the helices are unwound, proteins called single-strand binding proteins (SSB) bind to the unwound regions, and prevent them for annealing. The replication process thus initiates, and the replication forks proceed in two opposite directions along the DNA molecule.

Primer Synthesis

The synthesis of a new, complementary strand of DNA using the existing strand as a template is brought about by enzymes known as DNA polymerases. In addition to replication they also play an important role in DNA repair and recombination.

However, DNA polymerases cannot start DNA synthesis independently, and require and 3′ hydroxyl group to start the addition of complementary nucleotides. This is provided by an enzyme called DNA primase which is a type of DNA-dependent RNA polymerase. It synthesizes a short stretch of RNA onto the existing DNA strands. This short segment is called a primer, and comprises 9-12 nucleotides. This gives DNA polymerase the required platform to begin copying a DNA strand. Once the primers are formed on both the strands, DNA polymerases can extend these primers into new DNA strands.

The unwinding of DNA may cause supercoiling in the regions following the fork. These DNA supercoils are relaxed by specialized enzyme called topoisomerase which binds to the DNA stretch ahead of the replication fork. It creates a nick in the DNA strand in order to relieve the supercoil.

Leading Strand Synthesis

DNA polymerases can add new nucleotides only to the 3′ end of an existing strand, and hence can synthesize DNA in 5′ → 3′ direction only. But the DNA strands run in opposite directions, and hence the synthesis of DNA on one strand can occur continuously. This is known as the leading strand.

Here, DNA polymerase III (DNA pol III) recognizes the 3′ OH end of the RNA primer, and adds new complementary nucleotides. As the replication fork progresses, new nucleotides are added in a continuous manner, thus generating the new strand.

Lagging Strand Synthesis

On the opposite strand, DNA is synthesized in a discontinuous manner by generating a series small fragments of new DNA in the 5′ → 3′ direction. These fragments are called Okazaki fragments, which are later joined to form a continuous chain of nucleotides. This strand is known as the lagging strand since the process of DNA synthesis on this strand proceeds at a lower rate.

Here, the primase adds primers at several places along the unwound strand. DNA pol III extends the primer by adding new nucleotides, and falls off when it encounters the previously formed fragment. Thus, it needs to release the DNA strand, and slide further up-stream to start the extension of another RNA primer. A sliding clamp holds the DNA in its place as it moves through the replication process.

Primer Removal

Although new DNA strands have been synthesized the RNA primers present on the newly formed strands need to be replaced by DNA. This activity is performed by the enzyme DNA polymerase I (DNA pol I). It specifically removes the RNA primers via its 5′ → 3′ exonuclease activity, and replaces them with new deoxyribonucleotides by the 5′ → 3′ DNA polymerase activity.

Ligation

After primer removal is completed the lagging strand still contains gaps or nicks between the adjacent Okazaki fragments. The enzyme ligase identifies and seals these nicks by creating a phosphodiester bond between the 5′ phosphate and 3′ hydroxyl groups of adjacent fragments.

نهاية

This replication machinery halts at specific termination sites which comprise a unique nucleotide sequence. This sequence is identified by specialized proteins called tus which bind onto these sites, thus physically blocking the path of helicase. When helicase encounters the tus protein it falls off along with the nearby single-strand binding proteins.

Fact File

The DNA replication process is almost error free with the help of 3′ → 5′ exonuclease activity of the DNA polymerases. DNA pol III proofreads the nucleotides being newly added to the strand. If a nucleotide has been incorrectly added, DNA pol III recognizes the error immediately, removes the incorrect base, adds the correct nucleotide, and then continues ahead.

الفرق بين تكرار الحمض النووي بدائية النواة وحقيقية النواة

Although the basic mechanism remains the same, eukaryotic DNA replication is much more complex, and involves a higher number of proteins and enzymes. The regulatory mechanisms for DNA replication are also more evolved and intricate.

  • In prokaryotes, DNA replication is the first step of cell division. On the other hand, eukaryotic DNA replication is intricately controlled by the cell cycle regulators, and the process takes place during the ‘S’ or synthesis phase of the cell cycle.
  • Unlike prokaryotic DNA, the eukaryotic DNA is always present in combination with histone proteins that are involved in regulation of gene expression. During replication, these proteins need to be removed just before the unwinding of DNA.
  • Owing to higher genomic size and complexity of eukaryotes, several origin and termination sites for replication are present along the DNA. The region between one set of origin and termination sites is called a replication unit or replicon, within which one event of replication takes place. This enables faster and more accurate DNA replication as compared to the prokaryotic system of having a single replicon.
  • The Okazaki fragments formed in prokaryotes are longer as compared to those in eukaryotes. في الإشريكية القولونية (E. coli) they are about 1000 to 2000 nucleotides long whereas in eukaryotes their length ranges between 100 and 200 nucleotides.
  • Another interesting difference in prokaryotic and eukaryotic DNA replication is in the termination step of replication. In prokaryotes, the two replication forks, moving in opposite directions along the circular DNA molecule, meet at the termination site, and replication halts. However, eukaryotic DNA being a linear molecule, the lagging strand is shorter than the template strand. To avoid the loss of genetic information through such shortening, chromosomal ends have a set of repetitive sequences called telomeres that comprise noncoding DNA.

Fact File

The human DNA is copied at about 50 base pairs per second. Due to initiation of replication at multiple locations, the process is completed within one hour. If this were not the case, it would take about a month to finish replicating a single chromosome!

The genes of an organism contain all the necessary information to synthesize the right molecule, in the right amounts, and at the right time. Replication is the way to ensure that this coded information is passed down to every cell of the body, and also to the successive generations. After all, as rightly pointed by Richard Dawkins:

“They are the replicators and we are their survival machines. When we have served our purpose we are cast aside. But genes are denizens of geological time: genes are forever.”

المنشورات ذات الصلة

الحمض النووي للميتوكوندريا أو mtDNA هو حمض deoxyribonucleic الموجود في عضيات الميتوكوندريا. تم اكتشاف هذا الحمض النووي بواسطة Margit و Sylvan Nass عبر المجهر الإلكتروني. أتاح هذا الاكتشاف الفهم والتفاهم

في الوقت الحاضر ، تعد كتابة الحمض النووي تقنية مستخدمة على نطاق واسع في مجال علم الوراثة. This tool has not only been useful in forensic and scientific studies of animals, but has also&hellip

DNA fingerprinting has revolutionized criminal investigations to pin down real culprits. As interesting as it sounds, it has a sophisticated step by step procedure. This article will give you complete&hellip


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


DNA replication is bidirectional and discontinuous explain your understanding of those concepts.

What are Okazaki fragments and how they are formed?

If the rate of replication in a particular prokaryote is 900 nucleotides per second, how long would it take 1.2 million base pair genomes to make two copies?

Explain the events taking place at the replication fork. If the gene for helicase is mutated, what part of replication will be affected?

What is the role of a primer in DNA replication? What would happen if you forgot to add a primer in a tube containing the reaction mix for a DNA sequencing reaction?


شاهد الفيديو: الاكسونات و الانترونات - التعديلات على ال mRna في الحقيقيات - انواع ال Rna polymerase في الحقيقيات (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Idal

    لا أستطيع المشاركة الآن في المناقشة - إنه مشغول للغاية. لكنني سأطلق سراحي - سأكتب بالضرورة أعتقد.

  2. Tygobar

    الفكرة الرائعة وهي في الوقت المناسب

  3. Jamarreon

    شكرا لك حيوي

  4. Kajigrel

    جملتك جيدة جدا

  5. Laomedon

    تمت زيارتها من قبل الفكر الرائع ببساطة

  6. Thinh

    هذا الموضوع مذهل فقط :) ، مثير للاهتمام بالنسبة لي)))



اكتب رسالة