معلومة

أنظمة الجينات المعروفة MicroRNA؟

أنظمة الجينات المعروفة MicroRNA؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هل كانت هناك أي أنظمة تم التحقق منها تجريبياً لـ microRNAs تستهدف مجموعة جينية (على سبيل المثال ، في السرطان ، ربما)؟


نعم فعلا. يوجد أدناه رابط لمراجعة ncRNA (الحمض النووي الريبي غير المشفر) ودورها في المرض. هناك العديد من الأمثلة في هذه المراجعة في جميع أنواع الأمراض ، أحدها هو miR-200 ، والذي يُعتقد أنه يلعب دورًا في بعض أنواع السرطان.

هناك أيضًا بعض الجداول في الورقة التي تسرد الجيرنا والمرض الذي ترتبط به. لديهم أيضًا مرجعًا لكل واحد ، لذلك يمكنك قراءة المزيد عن هذا الحمض الريبي النووي الريبي المعين ووظيفته ، بما في ذلك الجين الذي ينظمه.

http://www.nature.com/nrg/journal/v12/n12/full/nrg3074.html

لست متأكدًا مما إذا كانت هذه المقالة مفتوحة للجمهور أم لا. إذا لم تتمكن من الوصول إليه ، فيمكنك دائمًا التحقق من إدخال ويكيبيديا لـ miR-200

http://en.wikipedia.org/wiki/Mir-200


PMAMCA: التنبؤ برابطة أمراض الرنا الميكروي باستخدام نهج إكمال المصفوفة

أشارت العديد من النتائج التجريبية إلى أن microRNAs (miRNAs) تلعب دورًا حيويًا في العمليات البيولوجية ، فضلاً عن تفشي الأمراض على المستوى الجزيئي. على الرغم من دورها المهم في العمليات البيولوجية ، فإن المعرفة المتعلقة بالوظائف المحددة للـ miRNAs في تطور الأمراض البشرية محدودة للغاية. أثناء محاولة حل هذه المشكلة ، تم اقتراح العديد من الأساليب الحسابية وجذبت اهتمامًا كبيرًا. ومع ذلك ، فإن معظم الأساليب السابقة تعاني من مشكلة شائعة تتمثل في عدم قابليتها للتطبيق على الأمراض الجديدة دون وجود أي ارتباطات معروفة بمرض ميرنا.

نتائج

تقترح هذه الورقة طريقة جديدة لاستنتاج ارتباطات المرض-ميرنا باستخدام تقنية التعلم الآلي تسمى عامل المصفوفة ، والتي تستخدم على نطاق واسع في أنظمة التوصية. في أنظمة التوصية ، الهدف هو توقع درجات التقييم التي قد يخصصها المستخدم لعناصر معينة. من خلال استبدال المستخدمين بـ miRNAs وعناصر بها أمراض ، يمكننا أن نتوقع بكفاءة ارتباطات مرض miRNA بدون بذور miRNAs. نتيجة لذلك ، فإن نموذجنا المقترح ، المسمى التنبؤ برابطة أمراض الحمض النووي الريبي الدقيقة باستخدام نهج إكمال المصفوفة ، يحقق أداءً ممتازًا مقارنة بالنُهج السابقة بقيمة AUC موثوقة تبلغ 0.882 من خلال تنفيذ التحقق من صحة خمسة أضعاف.

الاستنتاجات

على حد علمنا ، فإن الطريقة المقترحة تطبق تقنية إكمال المصفوفة لاستنتاج ارتباطات مرض ميرنا والتغلب على مشكلة البذور ميرنا التي تؤثر سلبًا على النماذج الحسابية الحالية.


الحمض النووي الريبي غير المشفر في أمراض القلب والأوعية الدموية

بييرلويجي ليزيزا. جيانفرانكو سيناغرا ، في Nucleic Acid Nanotheranostics ، 2019

5.3.1.1 الإسفنج miRNA

إسفنج ميرنا عبارة عن جزيئات مصممة لاحتواء مواقع ربط متعددة لـ miRNAs ، وتعمل كمثبطات تنافسية لإقران miRNA-mRNA. يمكن تعديل الإسفنج أو زيادة أو تقليل عدد مواقع الربط لـ miRNAs وتعديلها لتكون مكملة جزئيًا أو كليًا لـ miRNA ، بما في ذلك المباعدات بين مواقع الربط. 188 كل هذه التعديلات قادرة على التأثير على نشاط الإسفنج ، وتقارب الارتباط ، وخطر تدهور الإسفنج ، وإعادة التركيب الجيني. قد تحتوي إسفنجيات ميرنا على مواقع ربط لميرنا مستهدف مختلف عندما يكون تثبيط ميرنا متعددًا مطلوبًا لتحقيق تأثير علاجي. 189 تطورات إسفنجيات ميرنا هي "أفخاخ صعبة" ومحايات ميرنا ومازرات ميرنا. تحتوي الأفخاخ الصعبة على موقعين من مواقع ربط ميرنا في منطقة أحادية الجديلة من حلقات جذعية قصيرة وتتميز بقدرة ربط طويلة الأمد للـ ميرنا أكثر من إسفنجيات ميرنا التقليدية. تحتوي محايات 190 miRNA على التسلسل المضاد للمعنى من miRNA المستهدف مع تقارب ارتباط عالي لاستهداف miRNAs. 191


أساليب

أهداف ميرنا وشبكات التفاعل المستهدفة

أظهرت الدراسات الحديثة موثوقية عالية لأهداف ميرنا التي تنبأ بها TargetScan [7]. لذلك اخترنا الأهداف لجميع miRNAs البشرية المدرجة في قاعدة بيانات TargetScan. حصلنا على مجموعة من 677 miRNAs و 18880 بروتينًا مستهدفًا فريدًا. احتوت شبكة بروتين ميرنا الناتجة على 224،316 تفاعلًا. للتنبؤ بأهداف ميرنا بناءً على بيانات PAR-CLIP ، تم استخدام المناطق التي تركز على الارتباط المتشابك (CCRs) من مكتبات AGO-PAR-CLIP المدمجة [13]. تم إجراء تنبؤ الموقع المستهدف لجميع CCRs باستخدام برنامج RNAhybrid [14] باستخدام المعلمات الافتراضية. من القائمة الناتجة ، قمنا بتصفية جميع التوقعات بقيمة p أقل من 0.02 ودرجة طاقة أقل من 25 ٪ مقلل. نتج عن ذلك قائمة نهائية لـ miRNA-mRNA تضم 50160 تفاعلًا متوقعًا.

رابطة مجمعات البروتين مع مجموعات الهدف ميرنا - اختبار للدلالة الإحصائية

استخدمنا اختبار فيشر الدقيق لتعيين أهمية الارتباط بمجمعات البروتين لكل مجموعة أهداف ميرنا. تُعطى قيمة P فوق الهندسية على أنها الاحتمال الذي يمكن أن نتوقع تحته على الأقل ن ج تستهدف miRNA بالصدفة في مركب بروتيني ، إذا اخترناها عشوائيًا ن ر (العدد الإجمالي لأهداف ميرنا) بروتينات من المجموعة الإجمالية للبروتينات N التي تتكون من جميع أهداف ميرنا ن تي وجميع البروتينات في مجمعات ن ج . تم تصحيح قيم P للاختبار المتعدد لـ 677 miRNAs باستخدام طريقة تصحيح Holm-Bonferroni. قمنا بتعيين ارتباط المجمعات ومجموعات miRNA باستخدام اتحاد الأهداف من جميع miRNAs داخل مجموعة واحدة. هنا ، اختبرنا التداخلات الكبيرة لهذه المجموعات الموحدة بين مكونات المجمع بنفس طريقة مجموعات أهداف ميرنا الفردية.

إثراء العمليات البيولوجية

من أجل اختبار الإثراء الكبير للوظائف البيولوجية استنادًا إلى مسارات الأنطولوجيا الجينية (GO) [15] و KEGG [16] ضمن مجموعة الأهداف في مجمعات البروتين ، تم استخدام حزمة R GOstats [17]. تم استخراج مجموعة من المكونات المستهدفة من 722 مركب بروتين مستهدف ومقارنتها بمجموعة من البروتينات التي تتكون من جميع مكونات هذه المجمعات.

مقارنة توزيعات التغيير أضعاف

استخدمنا قياسات تغيير أضعاف بعد الإفراط في التعبير عن miRNAs مختارة من دراسات البروتينات الحديثة [6 ، 7]. لقد اخترنا لكل من هذه الجزيئات الدقيقة ، مجمعات البروتين التي تتكون من واحد على الأقل من أهدافها. تم بناء مجموعة من مكونات هذه المجمعات البروتينية. ضمن هذه المجموعة ، قمنا بمقارنة التغييرات الطية للمكونات التي تكون أهدافًا لـ miRNA المحدد مع التغييرات الطية للمكونات غير المستهدفة. تم ذلك عن طريق إجراء اختبار Kolmogorov-Smirnov من جانب واحد لكل من miRNAs التي تم فحصها في دراسات البروتينات.

زراعة الخلايا

تم شراء خلايا PANC-1 من ATCC (ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). الحيوانات المستنسخة PANC-1 مستقرة لـ ميل 141 أو ميل 200 ج تم الحصول عليها بتسلسل تم التحقق منه من بلازميدات pRetroSuper-miRNA. تمت زراعة خطوط الخلايا في ظل ظروف قياسية في DMEM + 10٪ مصل بقري جنيني + 2 ميكروغرام / مل من بوروميسين. من أجل الضربة العابرة ، تم نقل PANC-1 باستخدام siRNA الذي يستهدف ZEB1 (r (aga uga uga aug cga guc g) d (TT)) ، CtBP2 (1: r (cuuuggauucagcgucaua) d (TT) ، 2: r (cuuuguaacugauucugga) د (TT)) أو GFP (r (gcu acc ugu ucc aug gcc a) d (TT) تم إجراء جميع عمليات التحويل ومقايسات المراسل كما هو موضح سابقًا [18].

مقايسة محددة لتعديل ميرنا

تم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المستنبتة باستخدام مجموعة عزل ميرنا ميرنا (أمبيون ، أوستن ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم قياس قيم تعبير mRNA في ثلاث نسخ باستخدام Roche LightCycler 480 وتم تطبيعها لتعبير b-actin كعنصر تحكم في التدبير المنزلي. تم حساب قيم التعبير وفقًا للمرجع [19].

اللطخات المناعية

تم إجراؤها باستخدام البروتوكولات القياسية المعدلة. باختصار ، تم صنع مستخلصات الخلايا الكاملة من الخلايا في Triple Lysis Buffer [50 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl 8 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0،02٪ (وزن / حجم) NaN3، 0.5٪ (وزن / حجم) NaDeoxycholate ، 0.1٪ SDS ، 1٪ (v / v) NP40]. تم فصل المستخلصات (10 ميكروغرام / ممر) على هلام SDS-polyacrylamide بنسبة 10٪ ، وتم مسحها على غشاء PVDF ، واحتضانها بالأجسام المضادة الأولية المشار إليها المخففة في حاجز عازل (5٪ حليب جاف غير دسم) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسل والحضانة بالأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالبيروكسيديز المقترنة بالأنواع ، تم تطوير الإشارة باستخدام الركيزة SuperSignal West PICO Chemiluminescent (Perbio Science ، بون ، ألمانيا) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة. CtBP2 ، CDYL ، RCOR3 ، β-actin و ZEB1 تم الكشف عن المناعة باستخدام الأجسام المضادة الأولية التالية:CtBP2 الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر (1: 8.000 ، BD Transduction Laboratories ™ ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية) ،CDYL الجسم المضاد متعدد الأضلاع للأرنب (1: 500 ، Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة) ، مضاد-RCOR3 الجسم المضاد متعدد الأضلاع للأرنب (1: 1000Abcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدة)β-أكتين الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر (1: 5.000 ، Sigma-Aldrich Chemie GmbH ، ميونخ ، ألمانيا). المضادZEB1 كان الجسم المضاد متعدد الأضلاع للأرنب (1: 20.000) هدية من د.س. دارلينج ، جامعة لويزفيل ، لويزفيل ، كنتاكي ، الولايات المتحدة الأمريكية.


نتائج

تقييم تمايز MDSC

تم تقييم تمايز الخلايا من خلال التشكل ، MHC و desmin المناعي ، وكذلك التعبير الجيني MRF. تم اشتقاق MDSCs البقري من الثقافة الأولية للأنسجة العضلية وتم إنشاء الأنابيب العضلية المنصهرة عن طريق استنبات MDSCs في DM لمدة 1 و 3 أيام (الشكل 1 أ). في MDSC-P ، لم يتم التعبير عن جينات MHC و desmin ، لكنها كانت في MDSC-D1 و MDSC-D3 (الشكل 1 ب ، ج). أظهر تحليل التعبير الجيني MRF أن جينات PAX3 و MYF5 كانت خاضعة للتنظيم المنخفض ، بينما تم تنظيم جينات MYOG و MYF6 و MHC في MDSC-D1 و MDSC-D3 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC-P (الشكل 1 د). أشارت هذه النتائج إلى أن MDSCs كانت في عملية التمايز في MDSC-D1 و MDSC-D3 ولكن ليس MDSC-P ، حيث كانت MDSCs في الانتشار فقط.

توصيف مورفولوجيا وتألق مناعي من MDSCs. أ مورفولوجيا MDSCs أثناء التمايز لمدة 0 و 1 و 3 أيام (MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 ، على التوالي) ب الكشف عن التألق المناعي لـ MHC في MDSCs أثناء التمايز في MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 ج الكشف عن التألق المناعي لـ desmin في MDSCs أثناء التمايز في MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3. د التعبير عن MRF أثناء تمايز MDSC. تحليل RT-qPCR لجينات PAX3 و MYOD و MYOG و MYF5 و MYF6 في MDSC-D1 و MDSC-D3 مقارنةً بـ MDSC-P. يشير شريط الخطأ إلى الخطأ المعياري لمتوسط ​​العينات الثلاثية. *ص & lt 0.05 **ص & لتر 0.01

جمع الخلايا والتسلسل عالي الإنتاجية من الحمض النووي الريبي الصغير

لتحديد الحمض النووي الريبي الصغير في MDSCs أثناء التمايز ، تم استخدام إجمالي RNAs من MDSCs في مراحل تمايز مختلفة لإنشاء مكتبات RNA صغيرة. حصلنا على 5،871،055 قراءة نظيفة من مكتبة MDSC-P ، و 5،922،188 من مكتبة MDSC-D1 و 5،935،963 من مكتبة MDSC-D3 بعد حذف بعض قراءات الملوثات (الجدول 1). أظهر تحليل توزيع الطول أن معظم القراءات تراوحت بين 21 و 23 nt. كانت النسبة المئوية للقراءات 22-nt في إجمالي القراءات 72.76 و 71.26 و 75.58٪ في مكتبة MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 ، على التوالي (الشكل 2). تمت مطابقة قراءات المكتبات الثلاث (5،188،810 ، 5،041،921 و 5،236،492 ، على التوالي) تمامًا مع جينوم الأبقار (الجدول 2).

توزيعات أطوال الرنا الصغيرة في مكتبات الرنا الثلاث. تمثل الأعمدة البيضاء توزيعات طول الحمض النووي الريبي الصغير في مكتبة MDSC-P تمثل الأعمدة الرمادية توزيعات طول الحمض النووي الريبي الصغير في مكتبة MDSC-D1 تمثل الأعمدة السوداء توزيعات طول الحمض النووي الريبي الصغير في مكتبة MDSC-D3

تحديد miRNAs الأبقار المحفوظة

لتحديد miRNAs المحفوظة في MDSCs أثناء التمايز ، تم البحث في Blastn عن جزيئات RNA الصغيرة التي يبلغ طولها 18-23 نيوكليوتيدات مقابل miRBase 21.0 (إصدار إصدار miRBase V21.0 ، 3 يوليو 2014). تم بعد ذلك تجميع مرشحي miRNA في 439 و 394 و 392 فئة تقابل 455 و 412 و 410 مواضع جينومية مستقلة في المكتبات الثلاث وفقًا لتشابه التسلسل (الجدول 3) ، منها 322 miRNAs متداخلة في ثلاث مكتبات (ملف إضافي 2 ).

تم توضيح التعبير عن miRNAs المعروفة من خلال إنشاء السجل2 مؤامرات النسبة ومخططات التشتت (الشكل 3). يتم عرض ملفات تعريف التعبير بين المكتبات المختلفة في ملف إضافي 3. وأظهرت النتائج أن 296 miRNAs تتألف من 9 معبرًا عن أعلى (الجدول 4) و 165 معبرًا لأسفل و 122 miRNAs معبرًا عنها بالتساوي في MDSC-D1 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC- تتألف P 304 miRNAs من 15 معبرًا عن الارتفاع (الجدول 4) ، و 145 معبرًا لأسفل ، و 144 من miRNAs المعبر عنها بالتساوي في MDSC-D3 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC-P 273 miRNAs التي تتألف من 17 معبرًا ، و 55 معبرًا لأسفل ، و 201 بالتساوي عبرت miRNAs في MDSC-D3 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC-D1. الملف الإضافي 4: يسرد الجدول S1 أكثر 10 miRNAs وفرة في MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3. كان mRNA مع أكبر عدد في MDSC-D3 هو miR-206 ، وهو ميرنا رئيسي في نمو العضلات والهيكل العظمي ، بمتوسط ​​عدد قراءة طبيعي يبلغ مليون و GT. تم التعبير عن أعضاء let-7 في كل مكان ، let-7a-5p ، let-7f ، و let-7b ، متبوعًا ، وكان miR-1 خامس أكبر عدد. تم تجميع أنماط تعبير ميرنا أثناء تمايز MDSC باستخدام تحليل الكتلة الهرمي (ملف إضافي 5: الشكل S1). على سبيل المثال ، مقارنةً بمراحل الانتشار (MDSC-P) ، كانت مستويات التعبير عن miR-2443 و miR-423-5p و miR-181a و miR-10a و miR-206 أعلى في MDSC-D1 والنمط كان نفس طراز miR-139 و miR-1 و miR-95 و miR-206 و miR-133a في MDSC-D3.

التعبير التفاضلي عن miRNAs المحفوظة أثناء تمايز MDSCs. قارن تعبير miRNA المعروف بين مراحل التمايز المختلفة لمعرفة miRNA المعبر عنه تفاضليًا. كل نقطة في الشكل تمثل ميرنا. يُظهر المحور X والمحور Y مستوى التعبير عن miRNAs في مكتبتين. تمثل النقاط الخضراء miRNAs مع نسبة & gt 2 تمثل النقاط الزرقاء miRNAs بنسبة & lt ≤2 تمثل النقاط الحمراء miRNAs بنسبة ≤ 1/2. النسبة = التعبير الطبيعي في العلاج / التعبير الطبيعي في السيطرة

أظهر تحليل تحيز النيوكليوتيدات في كل موضع أن محتوى GC كان مرتفعًا في المواضع 2 و 11 و 15 بقيم 94.34 و 92.53 و 95.16٪ على التوالي ، ولكن ليس في الأول والسادس والتاسع والعاشر والثالث عشر والرابع عشر ، المراكز 16 و 22 و 24 بقيم 0.70 و 6.69 و 4.94 و 5.91 و 4.69 و 3.69 و 3.40 و 7.17 و 0.18٪ على التوالي في مكتبة MDSC-P. تم الحصول على نتيجة مماثلة في مكتبات MDSC-D1 و MDSC-D3. في جميع المكتبات ، تم توزيع النيوكليوتيدات A + U بشكل أساسي في المواضع المتبقية باستثناء المواضع الرابعة والخامسة والثامنة والثانية عشر والعشرون والثالثة والعشرون (ملف إضافي 6: الشكل S2). قد تكون ظاهرة تحيز النوكليوتيدات مرتبطة بآليات الحمض الريبي النووي الريبوزي ، مثل الارتباط بأهداف تنظيم الجينات. تم إثراء المواضع الأولى والتاسعة والنهائية بـ U وكانت الموضعان الأول والتاسع حدود "منطقة البذور" لميرنا الذي كان مسؤولاً عن استهداف الرنا المرسال لتنظيم الجينات [21]. تم الحصول على نتيجة مماثلة في MDSC-P miRNAs في المواضع الأولى والتاسعة والنهائية ، ولكن لم يكن هناك سوى 44.35٪ U في الموضع النهائي في MDSC-D1 و 58.21٪ في المركز التاسع في مكتبة MDSC-D3. قد تكون الاختلافات التي لوحظت بين دراستنا والدراسات السابقة بسبب الأساليب التجريبية المختلفة أو الاختلافات في العينات [12].

تسمى المواضع من 2 إلى 8 من ميرنا الناضجة منطقة البذور ، والتي يتم الحفاظ عليها بدرجة عالية. قد يختلف هدف mRNA مع تغيرات النيوكليوتيدات في هذه المنطقة. في دراستنا ، يمكن الكشف عن miRNAs التي قد تحتوي على تعديل أساسي عن طريق محاذاة علامات sRNA غير المُشار إليها مع miRNAs الناضجة من miRBase21 ، مما يسمح بعدم تطابق واحد في موضع معين. وأظهرت النتائج أن حالات عدم التطابق حدثت في جميع المكتبات الثلاث بنسبة 22.65 و 22.45 و 23.53٪ على التوالي. يمكن أن يكون سبب عدم التطابق هو التعديل اللاحق للنسخ ، و / أو RT-PCR ، وأخطاء التسلسل (ملف إضافي 7).

في دراستنا ، حدد التحليل الإضافي ما مجموعه 439 و 394 و 392 من الجزيئات المجهرية المحفوظة التي تنتمي إلى 237 عائلة ميرنا في المكتبات الثلاث المذكورة أعلاه. كانت أكبر عائلة ميرنا التي تم تحديدها هي miR-2284 ، والتي تتكون من 63 عضوًا ، و miR-154 و let-7 و miR-181/30 تمتلك 18 و 12 و 6 أفرادًا ، على التوالي ، عائلات miRNA الأخرى ، مثل miR-122 ، miR-1249 ، miR-140 ، و miR-486 ، كان لها عضو واحد فقط ، في حين أن miR-1940 و miR-2286 و miR-3431 و miR-574 لا تنتمي إلى أي عائلة جينية (ملف إضافي 8).

تحديد miRNAs البقري الجديد

يمكن استخدام بنية دبوس الشعر المميزة لسلائف miRNA للتنبؤ بـ miRNAs الجديدة. تم تطوير برنامج التنبؤ Mireap للتنبؤ بـ miRNAs الجديدة من خلال استكشاف البنية الثانوية ، وموقع انقسام Dicer ، والحد الأدنى من الطاقة الحرة لقراءات RNA الصغيرة غير الموصوفة التي يمكن تعيينها إلى الجينوم. استنادًا إلى التسلسل العميق HiSeq ، تم تحديد 53 miRNAs بقريًا جديدًا في MDSCs البقري ، والتي تتوافق مع 145 موقعًا جينوميًا. كانت ثلاثة وأربعون ميرنا جديدة في مكتبة MDSC-P ، و 17 كانت في MDSC-D1 ، و 19 كانت في مكتبة MDSC-D3 ، و 26 من miRNAs متداخلة في ثلاث مكتبات (ملف إضافي 9). غالبًا ما تُعتبر الأرقام المقروءة من التسلسل العميق HiSeq بمثابة تقدير كمي موثوق لتعبير miRNA ، وتظهر الأرقام المقروءة من miRNAs في تحليل التسلسل العميق HiSeq في ملف إضافي 10.

تم توضيح التعبير عن miRNAs الجديدة في MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 من خلال إنشاء سجل.2 قطع النسب ومخططات التشتت (ملف إضافي 11: الشكل S3). أظهرت النتائج أن 42 miRNAs تتألف من 7 معبرًا عن الارتفاع ، و 31 معبرًا لأسفل ، و 4 من miRNAs معبرًا عنها بالتساوي في MDSC-D1 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC-P 43 miRNAs التي تتألف من 8 معبرًا ، و 32 معبرًا لأسفل ، و 3 معبرًا عنها بالتساوي تتألف miRNAs في MDSC-D3 مقارنةً بتلك الموجودة في MDSC-P و 24 miRNAs من 9 معبرًا عن الارتفاع و 9 معبرًا لأسفل و 6 من miRNAs معبرًا عنها بالتساوي في MDSC-D3 مقارنة بتلك الموجودة في MDSC-D1.

أكد تحليل qPCR التعبير التفاضلي عن miRNAs المحددة في MDSCs

لتأكيد نتائج RNA-seq ، تم تحديد كمية التعبير عن 12 miRNAs بواسطة qPCR حلقة جذعية [22]. أظهرت النتائج أنه تم التعبير عن miR-29a و miR-27a و let-7i بشكل كبير في MDSC-P على النقيض من ذلك ، تم التعبير عن miR-320 و miR-1 و miR-206 بدرجة عالية في MDSC-D3. بالإضافة إلى ذلك ، تم تنظيم miR-206 و miR-1 و miR-320 أثناء تمايز MDSC miR-495 و miR-133b و miR-487 في MDSC-D1 وتم تنظيمها في MDSC-D3. كانت نتائج تحليل RT-qPCR متوافقة مع تلك التي تم الحصول عليها من خلال تحليل RNA-seq باستثناء miR-423 ، الذي تم تنظيمه في MDSC-D3 مقارنةً بـ MDSC-D1 في RT-qPCR ، بينما كان خاضعًا للتنظيم في RNA-seq (الشكل 4). أشارت هذه النتائج إلى أن التسلسل العميق HiSeq في دراستنا كان ذا موثوقية عالية.

التعبير عن miRNAs أثناء تمايز MDSC في الأبقار التي اكتشفها RT-qPCR. ملاحظة: MDSCs أثناء التفاضل في 0 و 1 و 3 أيام (MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 ، على التوالي) يشير شريط الخطأ إلى الخطأ المعياري لمتوسط ​​العينات الثلاثية. (* ص & lt 0.05 ** ص & lt 0.01 ، مقارنةً بـ MDSC-P بواسطة q-PCR. ∆ ص & lt 0.05 ، ∆∆ ص & lt 0.01 ، مقارنةً بـ MDSC-P بالتسلسل العميق)

هدف التنبؤ ل miRNAs

يتم تحديد وظيفة ميرنا في النهاية من خلال الجينات التي تستهدفها وبتأثيرها على التعبير عن هذه الجينات. لتحديد الأهداف المحتملة لـ miRNAs ، بحثنا في قاعدة بيانات mRNA البقري (ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/bosTau7/database/refGene.txt.gz). يسرد الجدول 5 الجينات المستهدفة التي تم الحصول عليها من MDSC-P و MDSC-D1 و MDSC-D3 ، والتي قد يتم تنظيمها بواسطة miRNAs في MDSC-D1 و MDSC-D3 و MDSC-P ، كما هو موضح في الملف الإضافي 12. طاقة الربط من miRNAs المحفوظة بأهدافها تراوحت من -11.2 إلى -44.3 كيلو كالوري / مول ومن 10.3 إلى -49.4 كيلو كالوري / مول بين miRNAs الجديدة وأهدافها (ملف إضافي 13). تحتوي بعض الجزيئات المجهرية الدقيقة على أكثر من 1000 هدف متوقع ، وتم تنظيم بعض الجينات المستهدفة الأخرى افتراضيًا بواسطة أكثر من اثنين من جزيئات الرنا المرسال.

تحليل التخصيب GO وتحليل مسار KEGG للجينات المستهدفة

لفهم الوظيفة البيولوجية لل miRNAs في MDSCs ، تم تصنيف جميع الجينات المستهدفة المتوقعة وفقًا للتعليقات التوضيحية الوظيفية KEGG ، والتي تساعد على تحديد المسارات التي تم تنظيمها بنشاط بواسطة miRNAs في MDSCs. شاركت معظم هذه الجينات في التمثيل الغذائي الخلوي ومسارات السرطان وتنظيم الهيكل الخلوي للأكتين ومسار إشارات MAPK (الجدول 6). كان المسار الأكثر شيوعًا هو المسار الأيضي ، حيث يمثل 1321 جينًا يمثل 12.44٪ من الإجمالي ، يليه المسارات في السرطان (3.51٪) ، والتخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية (3.46٪) ، وتنظيم الهيكل الخلوي الأكتين (3.17٪) ، و مسار إشارات MAPK (3.03٪). تم تقديم جميع الجينات المستهدفة المتوقعة لتحليل علم الجينات (GO) باستخدام نسخة عبر الإنترنت من برنامج Blast2GO (www.Blast2GO.com). في المجموع ، تم تصنيف 10887 جينًا جيدًا أو أفضل من 1 باستخدام علم الوجود المكون مع تحليل قيمة P ، وتم تعيين 10228 جينًا بوظائف مختلفة وتم تسمية 10،039 جينًا في العمليات البيولوجية (ملف إضافي 4: الجدول S2). لتحديد الوظائف المحتملة للتعبير المختلف miRNAs ، تم اختيار 45 miRNAs الأكثر وفرة في المكتبات الثلاث لتحليل علم الوجود الجيني. تضمنت فئات GO الرئيسية التي تستهدفها جينات التعبير المختلفة عملية النمو وموت الخلايا والنمو والعملية التناسلية وعملية التمثيل الغذائي (الشكل 5). هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لأهداف ميرنا وسيساعدنا على اكتساب نظرة ثاقبة لأدوار هذه الجزيئات في تمايز MDSC.

تحليل GO على أساس الجينات المستهدفة ميرنا. تم عرض GOs المستهدفة بواسطة miRNAs وفيرة. المحور الأفقي هو فئة GO والمحور الرأسي هو عدد الجينات


الجزء 2: المخالفة في تنظيم microRNA وما بعدها

00: 00: 15.02 مرحبًا. أنا ناري كيم من مركز أبحاث RNA
00: 00: 18.11 في IBS.
00: 00: 20.16 أعمل أيضًا في جامعة سيول الوطنية.
00: 00: 24.18 في الجزء الأخير من عرضي التقديمي ،
00: 00: 26.23 لقد تحدثت معك بشأنه
00: 00: 29.27 كيف يتم إنشاء وتنظيم الرنا الميكروي.
00: 00: 32.16 في هذا الحديث ، سأتحدث معك عن
00: 00: 36.26 نوع من تعديل الحمض النووي الريبي يُدعى Tailing ،
00: 00: 40.15 الذي يتحكم في التكوين الحيوي للـ microRNA
00: 00: 43.24 وأنواع أخرى من الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك الرنا المرسال.
00: 00: 49.26 إذن ، أكثر من 100 نوع من تعديلات الحمض النووي الريبي
00: 00: 54.20 تم وصفها حتى الآن.
00: 00: 56.11 تعديل RNA يمكن أن يكون على القاعدة أو مخلفات الريبوز.
00: 01: 03.10 بالإضافة إلى ذلك ، النيوكليوتيدات
00: 01: 06.19 يمكن إضافتها أو إزالتها من RNA.
00: 01: 09.14 كان مختبري مهتمًا بشكل خاص
00: 01: 13.04 في الجزء 3 'من الحمض النووي الريبي ، والذي نسميه ذيول.
00: 01: 17.29 في هذا العرض التقديمي ،
00: 01: 20.18 سأعرض عليكم بعض البيانات من المعمل
00: 01: 27.07 يوضح أنه ، في بعض الأحيان ،
00: 01: 29.23 يمكن للذيل أن يغير مصير الحمض النووي الريبي.
00: 01: 33.12 إذن ، هذا الخط من الدراسة
00: 01: 38.20 بدأ عندما كنا ندرس مسار الرنا الميكروي.
00: 01: 42.00 كما شرحت لك في الجزء الأول من الحديث ،
00: 01: 46.06 التولد الحيوي لل miRNA يتضمن
00: 01: 49.02 Pol II و Drosha و Exportin 5 و Dicer و Argonaute.
00: 01: 53.28 ويعتقد أن miRNAs ناضجة.
00: 01: 58.02 كان يُعتقد أنه نوع واحد.
00: 02: 03.07 لكن في الحقيقة ، إذا نظرت إلى بيانات التسلسل العميق.
00: 02: 07.25 هنا ، على اليسار ،
00: 02: 11.01 تشير الأرقام إلى الوفرة النسبية لأنواع ميرنا.
00: 02: 16.01 بصرف النظر عن التسلسل المرجعي الأكثر وفرة ،
00: 02: 19.19 يمكنك أيضًا العثور على أشكال إسوية إضافية.
00: 02: 23.07 أبرزها أن بعض الأشكال الإسوية لها
00: 02: 28.29 متواليات غير نموذجية أو متواليات U.
00: 02: 33.07 في نهاية ميرنا.
00: 02: 35.29 في الحيوانات ، As and Us
00: 02: 39.27 هي أكثر النيوكليوتيدات غير المصنفة شيوعًا
00: 02: 44.04 في نهاية 3 'من الحمض النووي الريبي.
00: 02: 46.14 في النباتات ، U هو الأبرز ،
00: 02: 50.10 كما تم وصفه في الأصل بواسطة مختبر Xuemei Chen.
00: 02: 55.06 إذن ، من أين تأتي هذه النيوكليوتيدات غير المصنفة؟
00: 03: 00.23 اتضح أن التحلل البولي يحدث ،
00: 03: 04.26 في الغالب ، قبل معالجة Dicer على pre-miRNA ،
00: 03: 09.15 بينما يحدث الغدد
00: 03: 14.20 بعد معالجة Dicer ، على 22 نوكليوتيد RNA.
00: 03: 20.14 لذلك ، يتم تنفيذ هذه التفاعلات
00: 03: 25.07 بواسطة مجموعة من بوليميراز (A) غير الكنسي ،
00: 03: 28.23 تُعرف أيضًا باسم ترانسالات يوريديل الطرفي.
00: 03: 33.02 من بين 7 بوليميرات غير متقنة (A) ، أو TUTases ،
00: 03: 39.09 TUT4 و TUT7 ،
00: 03: 43.25 التي لديها منظمات مجال مماثلة ،
00: 03: 47.21 لها وظائف زائدة في uridylation من pre-let7.
00: 03: 55.05 ماذا عن الغدد؟
00: 03: 57.04 تبين أن TUTase2 أو GLD2 ،
00: 04: 01.22 أو Wispy في الذباب ،
00: 04: 04.19 مسؤولة عن الأدينيل.
00: 04: 07.21 لكن قبل أن أبدأ في شرح اللائحة
00: 04: 11.05 عن طريق الذيل ،
00: 04: 13.13 أريد أن أوضح أن ترددات الذيل
00: 04: 16.08 منخفضة جدًا بشكل عام في معظم أنواع الخلايا
00: 04: 18.27 لمعظم miRNAs.
00: 04: 21.24 لذا ، أريدك أن يكون لديك انطباع
00: 04: 25.08 أن الذيل مهم دائمًا لجميع الجزيئات المجهرية.
00: 04: 30.22 ومع ذلك ، تردد المخلفات
00: 04: 34.27 يختلف باختلاف أنواع ميرنا وأنواع الخلايا.
00: 04: 38.13 والذيل يمكن أن يوفر أساسًا جزيئيًا
00: 04: 43.03 لتنظيم بعض الجزيئات المجهرية
00: 04: 46.02 في مراحل نمو محددة.
00: 04: 49.18 حسنًا ، لأعطيكم بعض الأمثلة
00: 04: 53.24 للتنظيم بوساطة الذيل.
00: 04: 56.15 الأول هو uridylation لـ pre-let-7.
00: 05: 00.28 يوجد في الواقع طريقتان على الأقل من التحلل البولي لـ pre-let-7.
00: 05: 05.12 الأول هو أحادي الطبقة
00: 05: 09.21 - يتم ذلك بواسطة TUT7 و TUT4 ،
00: 05: 13.25 ويعزز نظام monouridylation فعليًا معالجة Dicer ،
00: 05: 18.28 لذلك ، في هذا السياق TUTases
00: 05: 24.09 تعزيز التكاثر الحيوي Let-7 ،
00: 05: 27.12 بمثابة عامل حيوي.
00: 05: 29.14 ولكن بعد ذلك ، هذه هي حالة الخلايا الجسدية المتمايزة ،
00: 05: 34.03 لكن في الخلايا الجنينية والسرطان ،
00: 05: 36.28 يتم التعبير عن بروتين رابط لـ RNA يسمى Lin28 ،
00: 05: 44.21 وهي مرتبطة بـ pre-let-7
00: 05: 47.08 ويتفاعل مع TUTases
00: 05: 50.18 للحث على قلة القلة.
00: 05: 53.09 الآن ، ذيل U الطويل
00: 05: 56.15 يثبط معالجة Dicer ،
00: 05: 59.09 ويزيد من اضمحلال الحمض النووي الريبي.
00: 06: 03.19 إذن ، في ظل هذه الحالة ،
00: 06: 09.07 توتاس ، نفس الإنزيمات ،
00: 06: 11.11 يمكن أن تكون بمثابة منظمات سلبية.
00: 06: 13.21 إذن ، هناك ازدواجية وظيفية في تحليل اليوريد ،
00: 06: 17.22 اعتمادًا على طول ذيول uridylated
00: 06: 22.05 وسياق RNA وأنواع الخلايا.
00: 06: 28.29 من خلال القيام بذلك ، Lin28 و TUTases
00: 06: 35.07 يمكن أن يوفر مفتاحًا جزيئيًا في التطور
00: 06: 37.22 والتحولات المرضية ،
00: 06: 40.05 مثل السرطان.
00: 06: 41.28 المثال الثاني هو
00: 06: 46.21 غدّة من الجزيئات المجهرية الناضجة.
00: 06: 48.27 في هذا النشاف الشمالي من بيض وأجنة ذبابة الفاكهة ،
00: 06: 55.03 يمكنك أن تجد بعض مجموعات miRNA غير المتجانسة ،
00: 06: 59.26 مما يشير إلى غدة من miRNAs الناضجة.
00: 07: 04.00 هذه الأشكال الإسوية المتضخمة
00: 07: 07.15 تختفي عندما يتحرك الجنين إلى
00: 07: 11.07 مرحلته التطورية.
00: 07: 14.00 لاحقًا ، اتضح أن نفس النمط لوحظ في أنواع الحيوانات الأخرى ،
00: 07: 23.03 كما هو الحال في قنفذ البحر والفأر ،
00: 07: 27.14 يشير إلى أن هذه آلية محفوظة.
00: 07: 31.05 وجدنا لاحقًا أن إنزيمًا يسمى Wispy ،
00: 07: 35.11 بوليميراز بولي غير كنسي (A) ،
00: 07: 38.22 يتم التعبير عنه تحديدًا في البيض
00: 07: 41.06 ويحث على غدة ميرنا.
00: 07: 44.20 هذا طفرة من جين Wispy
00: 07: 47.06 وهنا تتراكم الجزيئات المجهرية كشكل غير معدل.
00: 07: 55.18 لذلك وجدنا أن الجزيئات المجهرية
00: 07: 58.14 يتم التحكم فيها ديناميكيًا أثناء تكوين البويضات المتأخر
00: 08: 02.01 والتطور الجنيني المبكر.
00: 08: 04.23 تودع mRNAs الأم
00: 08: 07.18 ثم تتدهور بسرعة أثناء التطوير ،
00: 08: 12.04 في حين أن الجزيئات المجهرية الملقحة
00: 08: 16.03 مستحثة من جينوم اللاقحة
00: 08: 18.11 لتحل محل السكان.
00: 08: 21.11 الآلية التي تقوم عليها هذه اللائحة
00: 08: 24.12 ينظمه Wispy ،
00: 08: 27.20 الذي يدين الميرنا للحث على التحلل السريع.
00: 08: 34.08 إذن ، أدينيل بوساطة Wispy
00: 08: 37.07 قد يساهم في إزالة جزيئات الحمض النووي الريبوزي من الأم
00: 08: 41.06 خلال فترة التحول التنموي الديناميكية هذه.
00: 08: 48.05 لقد شرحت لكم حتى الآن ،
00: 08: 50.24 في أنظمة الحيوانات ،
00: 08: 53.07 يوجد uridylation بالإضافة إلى adenylation
00: 08: 56.11 التي تتحكم في مصير مجموعة معينة من الجزيئات المجهرية
00: 09: 00.15 في أنواع خلايا محددة
00: 09: 02.25 والظروف التنموية.
00: 09: 05.08 لذا ، ننتقل إلى مسارات أخرى.
00: 09: 15.13 من المعروف أيضًا أن mRNAs لها ذيول ، ذيول بولي متعارف عليه (A) ،
00: 09: 19.01 لكننا نشعر بالفضول إذا كان هناك
00: 09: 27.09 أي أنواع أخرى من ذيول غير متعارف عليها على الرنا المرسال.
00: 09: 29.27 كنا نشعر بالفضول أيضًا إذا كان بإمكاننا التحقيق
00: 09: 34.11 وظيفة هذه التيول
00: 09: 37.24 عن طريق قياس طول ذيل بولي (A) بالمقياس الجينومي
00: 09: 40.28 وبدقة عالية.
00: 09: 43.16 الطرق الأخرى ، مثل النشاف الشمالي والمصفوفة الدقيقة ،
00: 09: 47.29 تم تطويرها ،
00: 09: 50.10 لكن الدقة والمقياس لم يكن جيدًا بما يكفي
00: 09: 53.29 للنظر في النسخة بشكل فعال.
00: 10: 00.01 لذلك ، قمنا بتطوير تقنية تسمى TAIL-seq ،
00: 10: 05.14 الذي يرسم تسلسل المصطلح 3 '.
00: 10: 08.03 فقط لأشرح لك البروتوكول بإيجاز ،
00: 10: 11.27 تم إثراء مجموع الحمض النووي الريبي بـ mRNA
00: 10: 17.00 حسب حجم التجزئة ونضوب الحمض النووي الريبي الريبوسومي.
00: 10: 22.16 تم ربط هذا بالمحول 3 '
00: 10: 25.09 يحتوي على بقايا البيوتين
00: 10: 28.26 بحيث ، بعد الهضم الجزئي ،
00: 10: 31.06 يمكننا هدم الجزء الأكبر 3'
00: 10: 34.21 باستخدام حبات الستربتافيدين.
00: 10: 38.23 ثم تم ربط القطعة
00: 10: 42.12 إلى محول مقاس 5 بوصات ومضخمًا بشكل أكبر بواسطة RT-PCR ،
00: 10: 49.03 وقمنا بتنفيذ تسلسل ثنائي الأطراف
00: 10: 52.05 للحصول على 51 نيوكليوتيد من القراءة 1
00: 10: 58.23 و 251 نيوكليوتيدات من قراءة 2.
00: 11: 02.00 تُستخدم القراءة 1 لتعيين RNA ،
00: 11: 06.18 للحصول على هوية النسخة ،
00: 11: 09.29 ويتم استخدام القراءة 2 للتحديد
00: 11: 13.25 تسلسل الذيل.
00: 11: 16.13 باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا التحديد بدقة
00: 11: 22.21 التسلسلات النهائية جدًا للـ RNAs ،
00: 11: 25.19 ولكن كان أحد التحديات التي واجهتنا ،
00: 11: 29.01 بسبب الطبيعة البوليمرية المتجانسة لذيول بولي (A) ،
00: 11: 32.23 إذا تعمقت في الذيل ،
00: 11: 36.07 تصبح جودة التسلسل سيئة حقًا ،
00: 11: 40.25 لذلك كان من الصعب جدًا الحصول على التسلسل الصحيح.
00: 11: 44.23 للتغلب على المشكلة ،
00: 11: 47.00 قمنا بجمع إشارات الفلورسنت
00: 11: 50.01 مباشرة من تفاعل التسلسل
00: 11: 52.27 ونظر إلى الصور من جهاز التسلسل ،
00: 11: 56.17 لاحظوا أن هناك انتقالًا
00: 12: 00.07 بين متواليات بولي (A)
00: 12: 03.20 ومتواليات غير بولي (A).
00: 12: 05.25 ويمكننا تحويل المعلومات
00: 12: 08.22 لحساب إشارة T النسبية ،
00: 12: 11.18 وأعطانا القدرة
00: 12: 17.06 لتحديد حالة المتتابعة
00: 12: 21.03 لتشفير طول الذيل المتعدد (A).
00: 12: 25.04 لذلك تمكنا من القياس بدقة
00: 12: 29.17 طول ذيل بولي (A) من mRNAs.
00: 12: 33.24 كان هذا مفيدًا جدًا ،
00: 12: 35.23 واسمحوا لي أن أعرض لكم بعض الأمثلة على قراءات TAIL-seq.
00: 12: 39.17 هذه هي القراءات العشوائية التي تتطابق مع p53 mRNA.
00: 12: 45.07 كما قلت ، هذا تسلسل مزدوج ،
00: 12: 49.08 لذلك من قراءة 1 ، والتي تظهر باللون الأزرق ،
00: 12: 52.25 تستخدم للحصول على هوية النسخة ،
00: 12: 58.19 ثم يتم استخدام Read 2 ل
00:13:02.29 learn about the sequences of the tail.
00:13:06.12 From this dataset,
00:13:09.01 we could determine precisely
00:13:13.08 the poly(A) tail length of the mRNA.
00:13:15.19 In addition, we could of course look at
00:13:20.14 the 3' end of the RNA
00:13:23.16 to find some interesting terminal modifications,
00:13:26.00 such as uridylation and even guanylation.
00:13:31.07 So, TAIL-seq is very useful
00:13:34.23 in studying the regulation of poly(A) tails.
00:13:38.09 Shown here is an example
00:13:42.15 -- it's the TAIL-seq data from total cell lysate
00:13:45.19 and PABP immunoprecipitate.
00:13:48.15 PABPC1 is a poly(A) binding protein.
00:13:52.03 On the x axis you have poly(A) tail length
00:13:56.06 and on the y axis you can see the fraction of reads.
00:14:00.20 This is a duplicated experiment
00:14:03.18 and you can see that input -- or total cell lysate --
00:14:08.26 gives a very reproducible result.
00:14:12.19 And from this distribution
00:14:18.05 you can learn that the median poly(A) length
00:14:22.26 is typically between 60-100 nucleotides
00:14:26.10 in mammalian messenger RNAs,
00:14:28.27 which is shorter than previously anticipated.
00:14:33.23 You can also learn that PABP, as you would expect,
00:14:42.26 binds preferentially to long poly(A) tails.
00:14:46.05 PABP is known to span 25 nucleotides,
00:14:50.23 so, on average, a poly(A) tail
00:14:54.11 can accommodate only 2-4 PABP molecules.
00:14:58.06 You can also use this technique
00:15:05.04 to study the 3' end modification of mRNA.
00:15:08.16 For instance, you can study uridylation of mRNA.
00:15:12.19 We were actually quite surprised to see
00:15:16.04 such widespread distribution of uridylation
00:15:20.02 on mammalian mRNAs.
00:15:21.27 This suggests that,
00:15:25.14 perhaps, uridylation is an integral part of the mRNA life cycle,
00:15:30.21 and even though mRNA uridylation
00:15:33.28 was observed in some individual mRNAs
00:15:36.16 from fungi and plants before,
00:15:41.04 this study collectively indicates that
00:15:47.10 this process may be preserved in eukaryotes.
00:15:51.17 To find out the function of uridylation,
00:15:56.05 we searched for the enzymes that are responsible for uridylation
00:16:01.01 and found that TUTases 4 and 7 mediate mRNA uridylation.
00:16:07.25 If you knock down TUTase 4 and 7 in HeLa cells
00:16:14.27 and carry out a TAIL-seq experiment,
00:16:19.14 uridylation frequency is reduced substantially,
00:16:22.29 particular the oligo-U tails.
00:16:27.12 So, what's the functional consequence of these enzymes?
00:16:34.06 To find out, we knocked down TUTase 4 and 7
00:16:38.26 and treated the cells with actinomycin D
00:16:44.01 and carried out an RNA-seq experiment
00:16:48.03 to measure the stability of mRNAs.
00:16:49.27 And we found that,
00:16:53.13 compared to control,
00:16:56.04 in TUT4 and 7 depleted cells,
00:16:59.09 the half-lives of mRNAs were globally increased,
00:17:02.17 indicating that TUTase 4 and 7 facilitate mRNA decay.
00:17:13.04 So, our study told us that
00:17:16.21 oligo-U tails serve as a decay mark for mRNAs,
00:17:21.13 as well as for pre-miRNAs.
00:17:24.08 To explain to you how messenger RNAs
00:17:27.28 are degraded in mammalian cells,
00:17:31.19 the active mRNA has a long poly(A) tail
00:17:36.04 that is bound to poly(A) binding protein,
00:17:39.12 but after the adenylation
00:17:43.20 the poly(A) tail gets shortened.
00:17:46.18 When it is below about 25 nucleotides,
00:17:49.20 PABP cannot bind to this mRNA any longer,
00:17:54.14 and this leads to the recruitment of decay factors.
00:18:03.00 It is known that this can happen in 5'-to-3' orientation
00:18:07.07 and 3'-to-5' orientation.
00:18:11.03 Our study shows that this can be facilitated
00:18:16.07 when TUTase 4 and 7
00:18:20.00 recognizes that adenylated mRNA
00:18:23.06 and uridylates the tail,
00:18:25.15 which recruits the decay factors more rapidly.
00:18:33.12 So, that was the role of uridylation
00:18:38.14 in the context of the mRNA pathway.
00:18:42.10 So, to wrap up this talk,
00:18:44.27 we have found that
00:18:49.20 tailing can provide important layers of gene regulation.
00:18:54.01 And tails can actually come in more than one flavor
00:18:59.14 -- not only canonical poly(A) tails,
00:19:02.13 but also noncanonical A tails, or U tails, or G tails.
00:19:09.18 And we have shown that noncanonical A tails
00:19:15.07 can destabilize maternal microRNAs.
00:19:18.10 And U tails can be used in various ways.
00:19:23.08 Oligo-U tail, in particular,
00:19:25.25 serves as a general decay mark
00:19:28.29 for both microRNA pathways and mRNA pathways.
00:19:33.23 With that, I would like to thank
00:19:36.29 all previous and present members of my lab,
00:19:40.22 but I would like to especially point out
00:19:45.25 Inha Heo, Chirlmin Joo, and Minju Ha
00:19:48.00 for the microRNA uridylation study
00:19:50.25 and Mihye Lee and Yeon Choi
00:19:53.24 for the microRNA adenylation study.
00:19:56.17 And mRNA tailing was studied
00:20:00.15 mainly by Hyeshik Chang, Jaechul Lim, and Minju Ha.
00:20:03.21 I also appreciate the help from our collaborators,
00:20:07.02 especially Dinshaw Partel's lab
00:20:11.04 and the funding from Institute for Basic Science.
00:20:16.01 Thank you very much for your attention.

  • Part 1: Biogenesis and Regulation of microRNA

Developmental conservation of microRNA gene localization at the nuclear periphery

microRNAs are of vital importance for the regulation of the adaptive and innate immune responses, modulating gene expression at the post transcriptional level. Although there is cumulative information regarding the steady state mature microRNA levels and their respective targets, little is known about the effect of the three-dimensional chromatin architecture on the transcriptional regulation of microRNA gene loci. Here, we sought to investigate the effect of subnuclear localization on the transcriptional activation of eight murine microRNA loci in the immune system. Our results show that microRNA genes display a preferential monoallelic gene expression profile accompanied with perinuclear localization irrespectively of their transcription status or differentiation state. The expression profile and perinuclear localization are developmentally conserved while microRNA gene loci localization outside constitutive lamin associated domains is cross-species conserved. Our findings provide support for an active nuclear periphery and its role in chromatin organization of the non-coding genome.

بيان تضارب المصالح

وقد أعلن الباحثون إلى أن لا المصالح المتنافسة موجودة.

الأرقام

Fig 1. Allelic expression profile analysis of…

Fig 1. Allelic expression profile analysis of microRNA gene loci reveals their preferential monoallelic expression…

Fig 2. microRNA gene loci are localized…

Fig 2. microRNA gene loci are localized in the cell nuclear periphery.

Fig 3. The perinuclear localization of microRNA…

Fig 3. The perinuclear localization of microRNA gene loci is independent of their transcriptional activity.

Fig 4. Perinuclear localization of microRNA gene…

Fig 4. Perinuclear localization of microRNA gene loci in Bach1 -/- thymocytes and BMDMs.

Fig 5. The perinuclear localization of microRNA…

Fig 5. The perinuclear localization of microRNA gene loci is developmentally conserved.


الملخص

A class of small, non-coding transcripts called microRNAs (miRNAs) that provide a crucial and pervasive layer of post-transcriptional gene regulation has recently emerged and become the focus of intense research. miRNAs are abundant in the nervous system, where they have key roles in development and are likely to be important mediators of plasticity. A highly conserved pathway of miRNA biogenesis is closely linked to the transport and translatability of mRNAs in neurons. Although there are nearly 500 known human miRNA sequences, each of only ∼ 21 nucleotides, which bind to multiple mRNA targets, the accurate prediction of miRNA targets seems to lie just beyond our grasp. Nevertheless, the identification of such targets promises to provide new insights into many facets of neuronal function.


Future perspectives

Gene expression, a quantitative and complex trait, has been extensively studied during the past few years, especially using the human cell line models and the HapMap genotypic data (53). Genetic variants like SNPs and CNVs have been found to contribute substantially to gene expression variation (57-63). Defining the roles of miRNAs in gene expression regulation, however, still have many important hurdles to cross. Before we could comprehensively understand the role of miRNAs in inflammatory lung disease, some basic research studies on their role in gene regulation (e.g., building a systematic and more reliable catalogue of miRNA gene targets) will prove to be critical and benefit the research community. For example, due to cost and efficiency, current miRNA target identification still relies largely on computational algorithms (e.g., miRanda used by the miRBase (71, 74), TargetScan (114, 115), PicTar (116)) that aim to take advantage of the biochemical/thermodynamic properties of the sequences of miRNAs and their gene targets. Although successful to some extent, the prediction results of these computational methods are generally uncorrelated and their predictions are often not supported by each other or by experimental evidence (117) such as those in TarBase (118) (a manually curated database of experimentally supported miRNA targets). Understandably, an approach that aims to integrate these different computational algorithms and/or genome-wide miRNA/mRNA expression data such as ExprTarget (http://www.scandb.org/apps/microrna/) (105), therefore, could have the potential to generate a more reliable and comprehensive catalogue of the gene targets regulated by miRNAs, thus benefiting the studies on their role in other biological processes and physiological pathways. For instance, it is expected that pathway analysis on a more reliable and comprehensive list of gene targets of differentially expressed miRNAs between patient samples and normal controls could help construct a more precise model for the mechanisms of ALI susceptibility.

Since significant gene expression variation have been observed between human populations (60-63), studying the role of miRNAs in regulating population differences in gene expression would provide novel insights in health disparities such as the higher mortality rate in ALI (as well as sepsis) in African Americans and Hispanics in the United States (13). Although socioeconomic status could significantly affect health disparities, notably, genes related to immune response to bacterial infection (e.g., genes in inflammatory pathways such as CCR7, chemokine receptor 7 and CXCR3, chemokine receptor 3) were found to be enriched among the differentially expressed genes between the cell lines derived from individuals of African and European ancestry (60, 119). Previous studies attempted to illustrate the contribution of SNPs and CNVs to population-level gene expression variation (60-63), similarly, it would be interesting to investigate the contribution of miRNAs to differential gene expression between populations as well, thus helping explain the observed racial difference in diseases including ALI. In addition, expression variation in some genes has also been observed between males and females using the cell line models (120, 121). Although genetics does not appear to affect gender-specific gene expression as males and females have the same autosomal genetic background, the contribution of miRNAs to gender-specific gene expression has not yet been studied. Therefore, it would be important to illustrate the role of miRNAs in defining gender-specific gene expression for the purpose of understanding the gender differences in inflammatory lung disease (e.g., gender differences in ARDS mortality rate (13)).

Because of the early stage of research, the current studies on the relationships between miRNAs and ALI/ARDS and VILI have been largely relied on animal models. No doubt, results derived from animal models can guide further investigations on patient samples and future translational research, the interpretation of these results, however, needs to be cautious as not all results from animal models are relevant to humans. Therefore, expanding the current studies to human cell lines, tissues and ultimately human subjects would provide direct evidence to the role of miRNAs in the development of inflammatory lung disease.

Since miRNA expression is believed to be a dynamic process in cells, future experimental techniques that may monitor the longitudinal changes of miRNAs في المختبر أو في الجسم الحي and their interactions with changing cellular environment could provide unprecedented picture of the critical role of miRNAs in gene regulation and disease development. Finally, to construct a most comprehensive model for complex diseases such as ALI presents the challenges for integrating all kinds of data on the phenotypes or traits (e.g., gene expression, SNPs, CNVs, DNA methylation). MiRNAs will be critical components in our complete understanding of the mechanism and genetic networks of inflammatory lung disease. Though with some promising evidence so far, before they can be applied in the daily management of ALI, the potential of miRNAs to be novel therapeutic targets as well as biomarkers for ALI should also be continuously investigated.


MicroRNA: A Master Regulator of Cellular Processes for Bioengineering Systems

microRNAs (miRNAs) are small RNAs 18 to 24 nucleotides in length that serve the pivotal function of regulating gene expression. Instead of being translated into proteins, the mature single-stranded miRNA binds to messenger RNAs (mRNAs) to interfere with the translational process. It is estimated that whereas only 1% of the genomic transcripts in mammalian cells encode miRNA, nearly one-third of the encoded genes are regulated by miRNA. Various bioinformatics databases, tools, and algorithms have been developed to predict the sequences of miRNAs and their target genes. In combination with the in silico approaches in systems biology, experimental studies on miRNA provide a new bioengineering approach for understanding the mechanism of fine-tuning gene regulation. This review aims to provide state-of-the-art information on this important mechanism of gene regulation for researchers working in biomedical engineering and related fields. Particular emphases are placed on summarizing the current tools and strategies for miRNA study from a bioengineering perspective and the possible applications of miRNAs (such as antagomirs and miRNA sponges) in biomedical engineering research.


شاهد الفيديو: Gene Silencing by microRNAs (يونيو 2022).


تعليقات:

  1. Samugis

    في رأيي ، ترتكب الأخطاء. أقترح مناقشته. اكتب لي في رئيس الوزراء ، تحدث.

  2. Giollabuidhe

    أعتقد أنك ترتكب خطأ. أرسل لي بريدًا إلكترونيًا إلى PM.

  3. Abraham

    أجب على طلبك - وليس المشكلة.



اكتب رسالة